Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.
Abstract
In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, subzelluläre Bruchteile von U937 Zellen ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder wahllose Reinigungsmittel zu erhalten. Diese Methode nutzt hypotone Puffer, Digitonin, mechanische lyse und differentielle Zentrifugation, Zytoplasma, Mitochondrien und Plasmamembran zu isolieren. Der Prozess kann skaliert werden, um den Bedürfnissen der Forscher, ist preiswert und unkompliziert. Diese Methode ermöglicht abschätzen, Protein-Lokalisierung in Zellen ohne spezielle Zentrifugen und ohne den Einsatz von kommerziellen Kits, die teuer werden können. Wir haben erfolgreich diese Methode cytosolischen trennen, Plasmamembran und mitochondrialen Proteine in die menschliche Monocyte-Zellinie U937 verwendet.
Introduction
Zuverlässige Identifikation von Protein-Lokalisierung ist oft notwendig, bei der Prüfung, molekulare Signalwege in eukaryotischen Zellen. Methoden, subzelluläre Brüche zu erhalten sind übernommen werden Forscher zelluläre Komponenten von Interesse näher zu untersuchen.
Die Mehrzahl der bestehenden Zelle Fraktionierung Methoden fällt in der Regel in zwei große Kategorien, Waschmittel-basierte1,2 und Ultrazentrifugation basierende3,4,5, die sein kann unterscheiden sich durch Schnelligkeit, Präzision und Kosten. Waschmittel je Protokolle verlassen sich auf die Verwendung von Puffern mit zunehmender Waschmittel Stärke um verschiedene Komponenten der Zelle zu solubilisieren. Dies kann ist eine schnelle und bequeme Methode für die Verarbeitung von Proben und kostengünstig, wenn die Anzahl und Größe der Proben klein sind. Waschmittel-basierte Kits können erworben werden, um cytoplasmatischen Membran/Organellen (Gemischter Bruch) und nukleare Fraktionen aus Zellen zu isolieren. Jedoch begrenzen einige Nachteile verbunden mit diesen Kits ihre Nützlichkeit für Forscher. Sie sind entworfen, um einfach ein oder zwei Komponenten der Zelle zu isolieren, aber nicht in der Lage alle Fraktionen aus einer Probe gleichzeitig zu isolieren. Die Verwendung von Reinigungsmitteln bedeutet, dass die Plasmamembran und Membran umhüllten Organellen ebenso solubilisiert werden werden und somit voneinander getrennt werden. Eine zusätzliche Schwierigkeit ergibt sich aus der proprietären Komponenten in diesen Kits, die verhindert, dass Forscher Bedingungen für spezifische Anwendungen zu verändern. Schließlich, sie sind in der Anzahl der Nutzungen eingeschränkt und möglicherweise unerschwinglich für größere Skala Experimente. Non-Reinigungsmittel basierend Kits gibt es für die Isolation von Mitochondrien, aber sie sollen nicht die Plasmamembran zu isolieren und die Probenausbeute ist deutlich geringer als die von Dichte Zentrifugierung isoliert Protokolle6,7 .
Methoden, die Ultrazentrifugation zu nutzen, um Brüche zu erhalten sind mehr zeitaufwendig, aber oft führen zu reiner Brüche als Waschmittel-basierte Kits. Um die Plasmamembranen von Zellen zu isolieren, ohne erste Gefäss-sie (was zu Kontaminationen mit Membran Organellen) verlangt, dass sie durch eine nicht-Reinigungsmittel-Methode, gefolgt von Trennung der zellulären Komponenten über differentielle lysiert werden Zentrifugation – mit der Plasmamembran Isolation erfordern Geschwindigkeiten von 100.000 × g zu erreichen. In vielen Fällen muss Isopycnic Dichte Gradienten Zentrifugation für weitere Trennung von zellulären Brüche oder Entfernung von Verunreinigungen differentielle Zentrifugation folgt. Während diese Methoden gründlich und veränderbar sind, gehören Nachteile, Kosten, Zeitaufwand und die Notwendigkeit einer Ultrazentrifuge zur Trennung von Fraktionen und weitere Reinigung über Dichte Steigung Zentrifugierung. Die meisten High-Speed-Zentrifugen sind Kosten, die für einzelne Ermittler und sind oft geteilt, Ausrüstung an Hochschulen core unerschwinglich ist. Auf diese Weise wird Ultrazentrifugen Verfügbarkeit in diesen Situationen unerschwinglich.
In diesem Protokoll Fraktionierung demonstrieren wir die Isolation der subzellularen Brüche ohne die Verwendung von Reinigungsmitteln Gefäss- und high-Speed Zentrifugation. Diese Methode erlaubt Forschern, die Plasmamembran, Mitochondrien und cytoplasmatische Komponenten einer eukaryotischen Zelle mit minimalen Kontamination zwischen den Fraktionen zu isolieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung dieses Protokolls entstand aus einer Unfähigkeit, mitochondriale trennen und Membran-Proben, mit handelsüblichen Kits für die Analyse von Protein-Lokalisierung während Necroptosis14. Die primäre Einschränkungen von vorgefertigten Kits sind ihre Unfähigkeit, auf die Bedürfnisse des einzelnen Forschers angepasst werden die Kosten pro Probe und begrenzte Anzahl von Proben können verarbeitet werden. Die hier vorgestellte Methode kann ohne den Einsatz von teuren Reagenzien und …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeit wurde unterstützt von NIH-1R15HL135675-01, Timothy J. LaRocca
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Referencias
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).
