उच्च गति के केंद्रापसारक के अभाव में U937 कोशिकाओं के सेल अंश
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल के लिए प्लाज्मा झिल्ली, कोशिका द्रव्य और U937 कोशिकाओं के mitochondria उच्च गति केंद्रापसारक के उपयोग के बिना अलग मौजूद हैं । इस तकनीक immunoblotting के माध्यम से प्रोटीन स्थानीयकरण के बाद परीक्षा के लिए उपसेलुलर भागों शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल में हम विस्तार एक विधि ultracentrifugation या अंधाधुंध डिटर्जेंट के उपयोग के बिना U937 कोशिकाओं के सेलुलर भागों प्राप्त करने के लिए । इस विधि hypotonic बफ़र्स, digitonin, यांत्रिक lysis और अंतर केंद्रापसारक कोशिका द्रव्य, mitochondria और प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए इस्तेमाल करता है । प्रक्रिया को शोधकर्ताओं की जरूरतों को समायोजित किया जा सकता है, सस्ती और सीधा है । इस विधि शोधकर्ताओं विशिष्ट केंद्रापसारक बिना कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए और वाणिज्यिक किट के उपयोग के बिना, दोनों जिनमें से नकारात्मक स्तर तक महंगा हो सकता है की अनुमति देगा । हमने इस विधि को मानव monocyte कोशिका रेखा U937 में cytosolic, प्लाज्मा झिल्ली और mitochondrial प्रोटीन को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक प्रयोग किया है ।
Introduction
प्रोटीन स्थानीयकरण की विश्वसनीय पहचान अक्सर आवश्यक है जब eukaryotic कोशिकाओं में आणविक रास्ते की जांच । तरीके सेलुलर भागों को प्राप्त करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जाता है और अधिक बारीकी से ब्याज की सेलुलर घटकों की जांच ।
मौजूदा सेल भिन्नीकरण विधियों के बहुमत आम तौर पर दो व्यापक श्रेणियों में गिरावट, डिटर्जेंट-आधारित1,2 और ultracentrifugation-आधारित3,4,5, जो हो सकता है गति, परिशुद्धता और लागत से विभेदित । डिटर्जेंट आधारित प्रोटोकॉल solubilize कोशिका के विशिष्ट घटकों के लिए बढ़ती डिटर्जेंट ताकत के साथ बफर के उपयोग पर भरोसा करते हैं । इस नमूने प्रसंस्करण के लिए एक तेजी से और सुविधाजनक तरीका है और संख्या और नमूनों की आकार छोटे हैं, तो लागत प्रभावी हो सकता है । डिटर्जेंट आधारित किट cytoplasmic, झिल्ली/organelle (मिश्रित अंश), और कोशिकाओं से परमाणु भागों को अलग करने के लिए खरीदा जा सकता है । हालांकि, इन किट के साथ जुड़े कई कमियां शोधकर्ताओं के लिए उनकी उपयोगिता सीमा । वे आसानी से सेल के एक या दो घटकों को अलग करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, लेकिन एक नमूना से सभी भागों को अलग करने में असमर्थ हैं समवर्ती. डिटर्जेंट के इस्तेमाल का मतलब है कि प्लाज्मा झिल्ली और झिल्ली से घिरा organelles समान रूप से solubilized होगा और, इसलिए, एक दूसरे से अलग होने में असमर्थ । एक अतिरिक्त जटिलता इन किट जो विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए शर्तों में फेरबदल से शोधकर्ताओं को रोकता में मालिकाना घटकों से उठता है । अंत में, वे उपयोग करता है की संख्या में सीमित है और बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए नकारात्मक स्तर तक महंगा हो सकता है । गैर-डिटर्जेंट आधारित किट mitochondria के अलगाव के लिए मौजूद है, तथापि, वे प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए डिज़ाइन नहीं कर रहे है और नमूना उपज है कि घनत्व से अधिक है कम है अलगाव6,7 प्रोटोकॉल आधारित .
तरीकों कि ultracentrifugation का उपयोग करने के लिए भागों को प्राप्त करने के लिए और अधिक समय लगता है, लेकिन अक्सर डिटर्जेंट से purer अंश में परिणाम आधारित किट । पहले उंहें solubilizing बिना कोशिकाओं से प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए (झिल्ली organelles के साथ संदूषण में जिसके परिणामस्वरूप) की आवश्यकता है उंहें एक गैर से लीजड ड होने के लिए-डिटर्जेंट अंतर के माध्यम से सेलुलर घटकों के विभाजन के बाद विधि केंद्रापसारक-प्लाज्मा झिल्ली अलगाव १००,००० × जी की गति की आवश्यकता के साथ पूरा करने के लिए । कई मामलों में, अवकलन केंद्रापसारक सेलुलर भागों या संदूषणों को हटाने के आगे जुदाई के लिए isopycnic घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया जाना चाहिए । हालांकि इन तरीकों को पूरी तरह से और संशोधित कर रहे हैं, कमियां लागत, समय की खपत में शामिल है, और अंशों के जुदाई के लिए एक ultracentrifuge के लिए की जरूरत है और आगे घनत्व ढाल केंद्रापसारक के द्वारा शुद्धि । सबसे उच्च गति केंद्रापसारक एक लागत है कि व्यक्तिगत जांचकर्ताओं के लिए निषिद्ध है और अक्सर साझा कर रहे हैं, अकादमिक संस्थानों में मुख्य उपकरण पर हैं । इस प्रकार, ultracentrifuge उपलब्धता इन स्थितियों में निषिद्ध हो जाती है ।
इस अंश प्रोटोकॉल में हम solubilizing डिटर्जेंट के उपयोग के बिना और उच्च गति केंद्रापसारक के बिना उपसेलुलर भागों के अलगाव का प्रदर्शन । इस विधि के शोधकर्ताओं प्लाज्मा झिल्ली को अलग करने के लिए अनुमति देगा, mitochondria और अंशों के बीच न्यूनतम संदूषण के साथ एक eukaryotic सेल के cytoplasmic घटकों.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का विकास necroptosis14के दौरान प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए, वाणिज्यिक उपलब्ध किट का उपयोग कर, mitochondrial और झिल्ली के नमूनों को अलग करने में असमर्थता से उठी । निर्मित किट की प्राथमिक ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कार्य NIH द्वारा समर्थित किया गया था-1R15HL135675-01 करने के लिए तीमुथियुस जे LaRocca
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Referencias
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