式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

カルシウムは、ホルモン分子合成^1,2,3伝達物質の放出、転写制御カスケードのシグナリングを含むほとんどの携帯電話のプロセスに関与しています。細胞内の自由なカルシウムの恒常性の維持は健康と細胞の機能に不可欠です。ストア作動性カルシウム エントリ (SOCE) カルシウムの枯渇に格納する小胞体 (ER) トリガー イオン チャンネルの開口部を容易にする膜のプロセスは、細胞内のカルシウムの恒常性の主要なメカニズムの 1 つ、さらに^4,5,6のシグナル伝達に使用できます、小胞体カルシウムの補充。TRP スーパーファミリーに属するカルシウム透過チャネルである、潜在的な一過性受容体チャンネル (TRPCs) は、SOCE^7,8,9の主要な参加者として識別されています。

TRPC 家族の 7 人のメンバーの間で TRPC3、TRPC6、および TRPC7 ホモログ サブグループを形成し、脂質二次メッセンジャー ジアシルグリセ ロール (DAG) シグナル伝達脂質の分解物によって活性化することで一意ホスファチジルイノシトール 4, 5-二リン酸 (PIP2)^10,11。TRPC3 は、平滑筋と神経伝達と神経新生^12,13に影響を与えるカルシウム シグナル伝達に重要な役割を果たしている脳の大脳と小脳の地域に強く表されます。TRPC3 の機能不全は、中枢神経系疾患、心血管疾患、卵巣腺癌^14,,1516など特定の癌にリンクされています。したがって、TRPC3 は、これらの疾患の治療のための医薬品のターゲットとしての約束を保持しています。TRPC3 作用する特化した医薬品の開発は、脂質結合サイト^17,18を含むその分子活性メカニズムの理解の欠如によって制限されており。我々 はこれらのメカニズムの¹⁹に重要な洞察を提供する人間 TRPC3 チャネル (hTRPC3) と閉じた状態その 2 つの脂質結合部位の最初の原子分解能の構造を報告しています。

高解像度での膜タンパク質の構造決定の重要な要因は、高品質の蛋白質を得ることです。高品質の蛋白質を得るに必要な発現と精製条件の対応するスクリーニングは、時間がかかり、高価な努力をすることができます。ここで表現と hTRPC3 は、私たちの最初のスクリーニングで不完全の浄化のための最適の条件を識別する方法を詳しく説明するプロトコルを提案する.トラブルシューティングおよび電顕 (Cryoem) 私たちの低温電子の固体基盤を築くタンパク質の動作を最適化する方法でいくつかの重要なポイントを紹介します。生成するベクトル (pEG) Gouaux と同僚が開発したスクリーニング アッセイおよび哺乳類細胞²⁰でバキュロ ウイルスの効率的な生成のために最適化されている変更された baculoviral を使用します。この表現方法は哺乳類の細胞膜のタンパク質の発現を迅速かつコスト効果の高い適切です。ベクトルの使用この蛍光検出のサイズ排除クロマトグラフィー ベースと (FSEC) 法²¹の細胞診を組み合わせています。このメソッドは、興味の構造を融合した緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグを使用して、小さな、細胞可溶化されたサンプルのターゲット蛋白質の可視化を向上させます。これは異なる洗剤や添加物、thermostabilizing の突然変異で、タンパク質の安定性のスクリーニングにより、小規模なトランスフェクション細胞の数が少ないを使用できます。このように、条件の多くを急速に大規模な蛋白質の浄化に移動する前に検査します。次の式、スクリーニング、および浄化を取得し、タンパク質のde novoの構造決定を生成する低温電子顕微鏡から画像を処理するためのプロトコルを提案する.ここで説明したアプローチ、TRP チャネル受容体および他の膜タンパク質の構造研究のための汎化可能なプロトコルとなることと考えています。