식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

칼슘 신호 폭포, 녹음 제어, 신경 전달 물질 방출, 및 호르몬 분자 합성^1,2,3등 가장 세포질 과정에서 포함 된다. 무료 cytosolic 칼슘의 항상성 유지 건강 및 세포의 기능에 결정적 이다. 세포내 칼슘 항상성의 주요 메커니즘 중 하나는 칼슘 저장소 운영 항목 (SOCE)는 칼슘의 소모에에서 저장 된 바인딩과 그물 (응급실) 트리거 이온 채널 개방 촉진 하기 위하여 플라즈마 멤브레인에 프로세스는 ^4,,56더 신호에 사용할 수 있는 ER 칼슘 보충 TRP superfamily 속하는 칼슘 침투성 채널은 일시적인 수용 체 잠재력 채널 (TRPCs), SOCE^7,,89 에 주요 참여자로 확인 되었습니다.

TRPC 가족에서 7 멤버 중 TRPC3, TRPC6, 및 TRPC7 homologue 하위 그룹을 형성 하 고 지질 보조 메신저 diacylglycerol (DAG)의 신호 지질 저하 제품에 의해 활성화 될 수 있는 고유 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PIP2)^10,11. TRPC3은 매우 부드러운 근육에 영향 neurotransmission 및 성체^12,13칼슘 신호에서 필수적인 역할을 재생 하는 두뇌의 대뇌와 소 뇌 영역에 표시 됩니다. TRPC3의 부전 중앙 신 경계 질환, 심혈 관 질환 및 난소 선 암^14,,1516등 특정 암에 연결 되었습니다. 따라서, TRPC3는 이러한 질병의 치료에 대 한 제약 대상으로 약속을 보유 하고있다. TRPC3에 특별히 대상된 약물의 개발 등 지질 바인딩 사이트^17,18, 분자 활성화 메커니즘의 이해의 부족에 의해 제한 되었습니다. 우리 보고 인간 TRPC3 채널 (hTRPC3)와 닫힌된 상태에 그것의 2 개의 지질 바인딩 사이트의 첫 번째 원자 해결책 구조¹⁹이러한 메커니즘 대 한 중요 한 통찰력을 제공.

높은 해상도에서 막 단백질의 구조를 결정 하기 위한 핵심 요소는 높은 품질의 단백질을 얻을 것입니다. 표현과 정화 조건 고품질 단백질을 얻기 위해 필요한의 해당 검사는 시간과 비용이 많이 드는 노력 될 수 있습니다. 여기 우리는 어떻게 우리가 식별 표현과 hTRPC3, 우리의 초기 심사에서 가난 하 게 행동의 정화에 대 한 최적의 조건을 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시. 우리는 해결 하 고 누워 우리의 cryo 전자에 대 한 견고한 기초 현미경 (cryo-EM) 연구 하는 단백질 동작을 최적화 하는 방법에 몇 가지 핵심 포인트를 제시. 수정된 baculoviral 생성 하는 벡터 (pEG), Gouaux와 동료에 의해 개발 된 심사 분석 및 포유류 세포²⁰에 잠재의 효율적인 생성에 대 한 최적화를 사용 합니다. 이 식은 메서드는 포유류 세포 막에 있는 단백질의 신속 하 고 비용 효율적인 overexpression에 적합 합니다. 우리는의 사용이 형광 검출 크기-배제 크로마토그래피 기반이 벡터 (FSEC) 방법²¹prescreening를 결합 한다. 이 메서드와 관심의 구조를 융합 하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그를 사용 하 여 작은, 전체 셀 solubilized 샘플에서 대상 단백질의 시각화를 향상 시킵니다. 이 다른 세제 및 첨가물, thermostabilizing 돌연변이와 단백질 안정성의 심사 가능 하며 소규모 과도 transfection에서 세포의 작은 숫자의 사용을 허용 한다. 이 방법에서는, 다양 한 조건 수 빠르게 상영 대규모 단백질 정화로 이동 하기 전에. 다음 식, 심사, 그리고 정화, 선물이 및 곳을 알아내는-EM 생성 단백질의 de novo 구조 결심 하에서 이미지를 처리 하는 프로토콜. 우리는 여기에 설명 된 방법을 일반화할 프로토콜 TRP 채널 수용 체와 다른 막 단백질의 구조 연구로 될 것입니다 믿습니다.