Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique
Summary
Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.
Abstract
Transient receptor potentiels chaînes (TRPCs) de la sous-famille TRP canonique sont non sélectifs cation qui jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie calcique, entrée de calcium particulièrement exploité au magasin, qui est essentielle pour maintenir le bon fonctionnement de la libération des vésicules synaptiques et voies de signalisation intracellulaire. En conséquence, les canaux TRPC ont été impliqués dans une variété de maladies humaines, y compris les troubles cardiovasculaires tels que l’hypertrophie cardiaque, les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et des troubles neurologiques comme l’ataxie spinocérébelleuse. Par conséquent, les canaux TRPC représente une cible pharmacologique potentielle dans les maladies humaines. Cependant, les mécanismes moléculaires de blocage dans ces canaux sont encore peu claires. La difficulté d’obtenir de grandes quantités de protéine purifiée, homogène et stable a été un facteur limitatif dans des études de détermination de structure, notamment pour les protéines de la membrane chez les mammifères tels que les canaux d’ion TRPC. Nous présentons ici un protocole pour l’expression à grande échelle des protéines de membrane de canal ion mammifères à l’aide d’un système de transfert de gènes modifiés baculovirus et la purification de ces protéines par affinité et chromatographie d’exclusion stérique. Nous présentons également un protocole pour recueillir des images de microscopie de cryo-électron de particule de protéine purifiée et d’utiliser ces images pour déterminer la structure des protéines. Détermination de la structure est une méthode puissante pour la compréhension des mécanismes de blocage et de fonction dans les canaux ioniques.
Introduction
Calcium est impliquée dans des processus plus cellulaires, y compris la signalisation des cascades, contrôle de la transcription, la libération des neurotransmetteurs et hormones molécule synthèse1,2,3. Le maintien homéostasie du calcium libre cytosolique est crucial pour la santé et la fonction des cellules. L’un des principaux mécanismes de l’homéostasie du calcium intracellulaire est entrée magasin fonctionnant de calcium (SOCE), un processus dans lequel épuisement du calcium stocké dans le réticulum endoplasmique (re) déclenche l’ouverture des canaux ioniques sur la membrane plasmique pour faciliter la reconstitution du calcium ER, qui peut ensuite être utilisé dans la signalisation plus4,5,6. Canaux des potentiels récepteurs transitoire (TRPCs), qui sont des canaux calcium-perméable appartenant à la super-famille TRP, ont été identifiés comme un acteur majeur dans le SOCE7,8,9 .
Parmi les sept membres de la famille des TRPC, TRPC3, TRPC6 et TRPC7 forment un sous-groupe homologue, et ils sont uniques dans la capacité à être activé par le lipides messager secondaire Diacylglycérol (DAG), un produit de dégradation des lipides signalisation phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 est fortement exprimée dans le muscle lisse et dans les régions de cérébrales et cérébelleuses du cerveau, où elle joue un rôle essentiel dans la signalisation calcique qui influent sur la neurotransmission et la neurogenèse12,13. Dysfonctionnement du TRPC3 a été lié à des troubles du système nerveux central, troubles cardio-vasculaires et certains cancers par exemple adénocarcinome ovarien14,15,16. Par conséquent, TRPC3 est prometteuse comme cible pharmaceutique pour le traitement de ces maladies. Le développement de médicaments ciblés agissant sur TRPC3 a été limité par un manque de compréhension de ses mécanismes moléculaires d’activation, y compris les lipides binding sites17,18. Nous avons rapporté la première structure d’atomique-résolution du canal TRPC3 humain (hTRPC3) et ses deux accepteurs lipidique dans l’état closed, fournissant des renseignements importants sur ces mécanismes19.
Le facteur clé pour déterminer la structure d’une protéine de membrane à haute résolution est d’obtenir des protéines de haute qualité. La projection correspondante d’expression et purification des conditions nécessaires à l’obtention de protéines de haute qualité peut être une démarche lente et coûteuse. Nous présentons ici un protocole décrivant en détail comment identifier les conditions optimales d’expression et purification de hTRPC3, qui se comportaient mal dans notre analyse initiale. Nous présentons plusieurs points clés sur la façon de résoudre les problèmes et d’optimiser le comportement de la protéine, qui jeter des bases solides pour nos cryo-électron études en microscopie (cryo-EM). Nous utilisons un baculoviral mis à jour le génération vector (pEG), développé par Gouaux et ses collègues, qui est optimisé pour le dépistage des dosages et génération efficace de baculovirus dans les cellules de mammifères,20. Cette méthode d’expression se trouve rapide et rentable de surexpression de protéines dans la membrane des cellules mammifères. Nous combinons l’utilisation de ce vecteur avec une taille-exclusion-la détection par fluorescence axée sur la chromatographie (FSEC) – présélection méthode21. Cette méthode utilise une balise de la protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée à la construction d’intérêt et améliore la visualisation de la protéine cible en échantillons solubilisées petite cellule entière. Cela permet pour le dépistage de la stabilité des protéines en présence de différents détergents et les additifs, les mutations thermostabilizing et permet l’utilisation d’un petit nombre de cellules de transfection transitoire à petite échelle. De cette façon, une multitude de conditions peut subir rapidement avant de passer à une purification de la protéine à grande échelle. La suite expression, criblage et de purification, nous présentons un protocole pour l’obtention et de traitement d’images de cryo-EM pour générer une détermination structurale de novo de la protéine. Nous croyons que les approches décrites ici servira un protocole généralisable pour des études structurales de récepteurs de canal TRP et autres protéines membranaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Détermination de structure des protéines par cryo-EM a révolutionné le domaine de la biologie structurale dans quelques années, grâce au développement d’algorithmes et de nouvelles caméras qui accélère considérablement la détermination de la structure des protéines qui ne sont pas cristalliser facilement, en particulier les protéines membranaires. Malgré tous les progrès récents dans la technique de cryo-EM, la préparation de protéines purifiées suffisantes en qualité et quantité pour faciliter la…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions G. Zhao Meng X. pour le soutien à la collecte de données à la David Van Andel Advanced Cryo-Electron Microscopy Suite. Nous apprécions l’équipe VARI High-Performance Computing pour soutien informatique. Nous donnons notre gratitude à N. Clemente, cotisations D., J. Floramo, Y. Huang, Kim Y., C. Mueller, B. Roth et Z. Ruan aux observations qui ont grandement amélioré ce manuscrit. Nous remercions D. Nadziejka d’aide à la rédaction de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par VARI interne de financement.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
Referencias
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