التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون
Summary
ويصف هذا البروتوكول التقنيات المستخدمة لتحديد هياكل قناة أيون بالميكروسكوب cryo-الإلكتروني، بما في ذلك نظام باكولوفيروس لكفاءة التعبير عن الجينات في خلايا الثدييات مع الحد الأدنى من الجهد وسمية واستخراج البروتين وتنقية، والتحقق من الجودة، وإعداد شبكة العينة والفحص، فضلا عن جمع البيانات وتجهيزها.
Abstract
عابر مستقبلات القنوات المحتملة (تربكس) من فصيلة الراديكالي المتعارف عليه هي قنوات الأيونات الموجبة نونسيليكتيفي التي تلعب دوراً أساسيا في التوازن الكالسيوم، دخول خاصة تعمل على تخزين الكالسيوم، هو أمر حيوي للحفاظ على وظيفة مناسبة من الإصدار حويصلة متشابك ومسارات الإشارات داخل الخلايا. وبناء على ذلك، قد تورط القنوات TRPC في مجموعة متنوعة من الأمراض البشرية بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية، مثل تضخم القلب واضطرابات الأعصاب مثل مرض باركنسون، واضطرابات الجهاز العصبي مثل ترنح spinocerebellar. ولذلك، تمثل قنوات TRPC هدفا دوائية محتملة في الأمراض التي تصيب الإنسان. بيد أن آليات الجزيئية النابضة في هذه القنوات لا تزال غير واضحة. كانت صعوبة الحصول على كميات كبيرة من البروتين مستقرة ومتجانسة، وتنقية عاملاً مقيداً في هيكل تصميم الدراسات، خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء الثدييات مثل قنوات أيون TRPC. نقدم هنا، على بروتوكول للتعبير على نطاق واسع من الثدييات أيون قناة بروتينات الغشاء باستخدام نظام نقل جينات باكولوفيروس معدلة وتنقية هذه البروتينات بالنسب وحجم الاستبعاد اللوني. ونقدم كذلك بروتوكولا لجمع الصور مجهرية واحدة-الجسيمات cryo-إلكترون من البروتين المنقي واستخدام هذه الصور لتحديد بنية البروتين. تصميم الهيكل وسيلة قوية لفهم آليات النابضة والدالة في قنوات أيون.
Introduction
ويشارك الكالسيوم في العمليات الأكثر الخلوية بما في ذلك إشارات التحكم النسخ والإفراج العصبي، الشلالات وهرمون جزيء توليف1،،من23. الحفاظ على التماثل الساكن سيتوسوليك الكالسيوم الحرة أمر حاسم لصحة ووظيفة الخلايا. إحدى الآليات الرئيسية لاستتباب الكالسيوم داخل الخلية هو الكالسيوم تعمل بمخزن الإدخال (سوسي)، المخزنة في المشغلات هيولى (ER) على استنزاف الكالسيوم الذي فتح قنوات أيون في غشاء البلازما لتسهيل عملية تجديد ER الكالسيوم، التي يمكن استخدامها بعد ذلك في زيادة الإشارات4،،من56. وقد حددت عابر مستقبلات القنوات المحتملة (تربكس)، وقنوات الكالسيوم نفاذية تنتمي إلى فوق عائلة الراديكالي، كمشارك رئيسي في سوسي7،،من89 .
من بين سبعة أعضاء في الأسرة TRPC، TRPC3، TRPC6، و TRPC7 تشكيل فريق فرعي المناظرة، وفريدة من نوعها في القدرة على تنشيط بواسطة دهن diacylglycerol رسول الثانوي (همرشولد)، منتج التحلل من الدهون مما يشير إلى فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (PIP2)10،11. وتعرب TRPC3 عاليا في العضلات الملساء وفي مناطق المخ والدماغ في الدماغ، حيث تقوم بأدوار أساسية في الكالسيوم مما يشير إلى أن تأثير كبيرة والخلايا،من1213. ارتبط ضعف TRPC3 لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي، واضطرابات القلب والأوعية الدموية، وبعض أنواع السرطان مثل غدية المبيض14،،من1516. ولذلك، يبشر TRPC3 كهدف الأدوية لعلاج هذه الأمراض. وقد حدت استحداث أدوية تستهدف على وجه التحديد بناء على TRPC3 عدم فهم آلياتها التنشيط الجزيئي، بما في ذلك الدهن ملزم مواقع17،18. أبلغنا بنية الذرية القرار الأولى للقناة TRPC3 البشرية (hTRPC3) ومواقع اثنين الدهن ملزمة في حالة مغلقة، توفير معلومات هامة عن هذه الآليات19.
العامل الرئيسي لتحديد هيكل بروتين الغشاء بدقة عالية للحصول على البروتين ذات جودة عالية. ويمكن فحص المقابلة للتعبير وتنقية من الشروط اللازمة للحصول على جودة عالية البروتين مسعى تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا. وهنا يقدم بروتوكول تصف بالتفصيل كيف يمكننا تحديد الظروف المثلى للتعبير وتنقية hTRPC3، التي تصرفت بشكل ضعيف في الفحص الأولى لدينا. نحن نقدم العديد من النقاط الرئيسية حول كيفية استكشاف أخطاء وإصلاحها وتحسين سلوك البروتين، التي ترسي أساسا متينا للبرد-إلكترون لدينا دراسات مجهرية (cryo-م). ونحن نستخدم باكولوفيرال معدلة توليد متجه (شماعة)، التي وضعتها جو والزملاء، والذي هو الأمثل للفحص فحوصات وكفاءة توليد باكولوفيروس في خلايا الثدييات20. هذا أسلوب التعبير من المناسب أوفيريكسبريشن سريعة وفعالة من حيث التكلفة للبروتينات في غشاء خلايا الثدييات. ونحن الجمع بين استخدام هذه المتجهات مع الأسفار-الكشف عن حجم استبعاد اللوني القائم (فسك) فرز طريقة21. هذا الأسلوب يستخدم علامة البروتينات فلورية خضراء (بروتينات فلورية خضراء) تنصهر فيها بناء تهم ويحسن تصور البروتين المستهدف في عينات سولوبيليزيد الصغيرة، وكامل الخلية. هذا يسمح لفحص البروتين الاستقرار حضور مختلف المنظفات والمواد المضافة، مع الطفرات ثيرموستابيليزينج، ويسمح باستخدام عدد صغير من الخلايا من تعداء عابر الصغيرة. وبهذه الطريقة، يمكن فحص العديد من الظروف سريعاً قبل أن ينتقل إلى تنقية بروتين على نطاق واسع. في أعقاب التعبير، والفرز، وتنقية، نقدم بروتوكول للحصول على ومعالجة الصور من البرد-م لتوليد تصميم هيكلي حيثياته من البروتين. ونحن نعتقد أن النهج الموصوفة هنا سيكون بمثابة بروتوكول التعميم لدراسات هيكلية الحزب قناة المستقبلات والبروتينات الغشاء الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
التصميم الهيكلي للبروتينات بالبرد-م قد أحدث ثورة في مجال البيولوجيا الهيكلي في السنوات القليلة الماضية، بفضل تطوير خوارزميات والكاميرات الجديدة أن يسرع إلى حد كبير على تصميم بنية البروتينات التي لا سهولة تتبلور، لا سيما غشاء بروتينات. على الرغم من كل أوجه التقدم الأخيرة في تقنية م البرد?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر تشاو زاي وعاشرا منغ للدعم بجمع البيانات على ديفيد فإن اندل متقدمة Cryo-إلكترون “مجهرية جناح”. ونحن نقدر أيضا فريق “فاري الحوسبة” عالية الأداء لدعم الحسابية. ونحن نقدم امتناننا كليمنتي، “مستحقات دال”، أ. ج. فلورامو، هوانغ Y. ويوسف كيم، جيم مولر، روث باء وروان Z. للتعليقات التي تحسنت كثيرا هذه المخطوطة. ونشكر “نادزيجكا د” لدعم التحرير لهذه المخطوطة. هذا العمل كان يدعمها فاري الداخلية التمويل.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
Referencias
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
