Summary

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

Published: November 17, 2018
doi:

Summary

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Abstract

We hebben een tool om zowel verrijken en uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen ontwikkeld. Dit kan handig zijn in gevallen zoals zijn naar A) detecteren van de aanwezigheid van antigeen-specifieke T-cellen, B) sonde de dynamiek van antigeen-specifieke reacties, C) begrijpen de invloed van antigeen-specifieke reacties op ziekte staat zoals autoimmuniteit, D) demystificeren heterogene Responsie voor antigeen-specifieke T-cellen, of E) gebruik maken van antigeen-specifieke cellen voor therapie. De tool is gebaseerd op een magnetische deeltje dat we conjugaat antigeen-specifieke en T-cel co-stimulatory signalen, en dat we noemen als kunstmatige antigeen presentatie van cellen (aAPCs). Bijgevolg, aangezien de technologie eenvoudig te produceren, het kan gemakkelijk worden aangenomen door andere laboratoria; dus is ons doel hier om te beschrijven in detail de fabricage en het latere gebruik van de aAPCs. We uitleggen hoe u koppelt van antigeen-specifieke en co-stimulatory signalen aan de aAPCs, hoe om ze te verrijken voor antigeen-specifieke T-cellen te gebruiken, en hoe uit te breiden van antigeen-specifieke T-cellen. Bovendien zullen we benadrukken technisch ontwerp overwegingen gebaseerd op experimentele en biologische informatie van onze ervaring met het karakteriseren van antigeen-specifieke T-cellen.

Introduction

Met de opkomst van de vele immuuntherapie is er een behoefte om te kunnen karakteriseren en beheren van de immuunrespons. Met name is de adaptieve immuunrespons van belang vanwege de specificiteit en de duurzaamheid van de cellen. Onlangs, chimeer-antigeen-receptor T celtherapieën zijn goedgekeurd voor kankertherapie; echter zijn de antigeen-receptoren gebaseerd uit het gemeenschappelijk cel surface antigeen CD19, in plaats van de antigenen die specifiek zijn voor de kanker-1. Buiten de specificiteit, kunnen immuuntherapie ook lijden aan het gebrek aan controle en beperkte begrip van de dynamische immuunrespons binnen kanker of autoimmuniteit.

Een van de uitdagingen van het bestuderen van antigeen-specifieke reacties is hun extreem lage frequentie, bijv., antigeen-specifieke T-cellen zijn 1 van elke 104 naar 106 T cellen2,3. Dus, om te onderzoeken welke T cellen aanwezig zijn of reageert, de cellen moeten ofwel worden verrijkt en uitgebreid, of hun signaal kan worden versterkt. Het is duur en moeilijk te handhaven van de cellen van de feeder met behulp van huidige technieken die gericht zijn op de uitbreiding van antigeen-specifieke cellen. Huidige technieken die gericht zijn op het versterken van het signaal van antigeen-specifieke T-cellen, zoals de immunospot van enzyme-linked (ELISPOT) assay, beperken het hergebruik van die T cellen4. Tot slot vanwege lage gevoeligheid moeten deze twee technieken vaak worden gecombineerd voor antigeen-specifieke opsomming.

Om deze kwesties te behandelen, hebben we de magnetische nanoparticle gebaseerde kunstmatige antigeen voorstellende cel (aAPC)5,6,7,8. De aAPC kan worden matiemaatschappij en een antigeen-specifieke signaal-peptide geladen grote histocompatibility complex (pMHC) – co-stimulatory moleculen –bv., een anti-CD28 antilichaam-zowel het verrijken van antigeen-specifieke T-cellen en dan vervolgens stimuleren hun expansie (Figuur 1). De deeltjes kunnen dus een kosteneffectieve off-the-shelf product dat kan worden zowel aangepast aan antigeen-specifieke stimulaties nog gestandaardiseerd over experimenten en patiënten. Uitvoeren van de verrijking en uitbreiding verwerken van resultaten in honderden tot duizenden-voudige expansie van antigeen-specifieke CD8 + T cellen en kan leiden tot frequenties tot 60 procent na één week, waardoor de karakterisering of het therapeutische gebruik van de grote aantal cellen. Hierin, we beschrijven hoe maak je nanoparticle aAPCs, sommige kritische overwegingen bij het kiezen van de nanoparticle eigenschappen, en enkele typische resultaten tonen met behulp van deze deeltjes in isoleren en zeldzame antigeen-specifieke CD8 + T cellen uit te breiden.

Protocol

Alle muizen werden onderhouden per richtsnoeren goedgekeurd door de Johns Hopkins University’s institutionele Review Board. 1. Laad Dimeric Major Histocompatibility Complex Immunoglobulin fusieproteïne (MHC-Ig) met gewenste antigeen Peptide opeenvolging. Opmerking: Als u met behulp van H – 2Kb: Ig, dan volgt het protocol beschreven in stap 1.1; Als met behulp van H-2Db:Ig, dan volgt het protocol beschreven in stap 1,2. Actieve laden van peptide reeks in H…

Representative Results

Om een succesvolle verrijking en uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen, moeten de peptide-geladen MHC-Ig en co-stimulatory moleculen worden met succes gekoppeld aan het aAPC deeltje. Op basis van de 3 methoden van deeltje bijlage, bieden wij enkele representatieve gegevens voor een succesvolle vervoeging procedure resultaat (figuur 5a). Inderdaad, als het ligand-dichtheid te laag is, dan zal niet er effectieve stimulatie van antigeen-specifieke CD8 + T…

Discussion

Hebben we een nieuwe antigeen-specifieke T celtechnologie van de isolatie op basis van kunstmatige antigeen nanoparticle presenteren cellen (aAPCs). Nanoparticle-aAPCs peptide-geladen MHC op het oppervlak waarmee antigeen-specifieke T cel bindende en activering naast co-stimulatory activeren. aAPCs zijn ook paramagnetisch, en dus kan worden gebruikt voor het verrijken van zeldzame antigeen-specifieke T-cellen met behulp van een magnetisch veld. Wij hebben geoptimaliseerd en studeerde van belangrijke nanoparticle eigensch…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jwh bedankt de NIH kanker nanotechnologie Training Center in het Johns Hopkins Instituut voor nanobiotechnologie, National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) en de bogen foundation voor de ondersteuning van de fellowship. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland innovatie-initiatief en de Coulter Foundation (JPS).

Materials

DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

Referencias

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Play Video

Citar este artículo
Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

View Video