Summary

利用磁性纳米粒子丰富和扩大罕见抗原特异性 t 细胞

Published: November 17, 2018
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Summary

抗原特异性 t 细胞由于其频率极低, 很难在治疗中表征或利用。在此, 我们提供了一个协议, 以开发一个磁性粒子, 它可以结合到抗原特异性 t 细胞, 以丰富这些细胞, 然后扩大他们的几百倍, 用于表征和治疗。

Abstract

我们开发了一种工具, 既能丰富又能扩大抗原特异性 t 细胞。这在 a) 检测抗原特异性 t 细胞的存在等情况下很有帮助, b) 探测抗原特异性反应的动态, c) 了解抗原特异性反应如何影响疾病状态, 如自身免疫性, d) 消除异质性的疾病状态抗原特异性 t 细胞 (e) 的反应利用抗原特异性细胞进行治疗。该工具是基于一个磁性粒子, 我们结合抗原特异性和 t 细胞共刺激信号, 我们将其称为人工抗原呈现细胞 (aAPCs)。因此, 由于该技术生产简单, 可方便地被其他实验室采用;因此, 我们在这里的目的是详细描述的制造和随后的使用的 apc。我们解释了如何将抗原特异性和共刺激信号附加到 aAPCs, 如何利用它们来丰富抗原特异性 t 细胞, 以及如何扩大抗原特异性 t 细胞。此外, 我们将根据我们在抗原特异性 t 细胞特征方面的经验的实验和生物学信息, 重点介绍工程设计方面的考虑。

Introduction

随着许多免疫疗法的兴起, 有必要能够描述和控制免疫反应。特别是, 由于细胞的特异性和耐久性, 适应性免疫反应是有意义的。最近, 嵌合体抗原受体 t 细胞疗法已被批准用于癌症治疗;然而, 抗原受体根据共同的细胞表面抗原 cd19, 而不是抗原特异性的癌症1。除了特异性之外, 免疫疗法还可能缺乏控制, 对癌症或自身免疫功能内的动态免疫反应了解有限。

研究抗原特异性反应的挑战之一是其极低的频率,例如, 抗原特异性 t 细胞是每 10 4 至 106 t 细胞 2,3中的1个。因此, 为了研究哪些 t 细胞存在或响应, 细胞要么需要丰富和扩大, 要么需要放大其信号。使用目前专注于抗原特异性细胞扩张的技术来维护馈线单元是昂贵和困难的。目前的技术, 重点是放大抗原特异性 t 细胞的信号, 如酶联免疫罐 (elispot) 检测, 限制了这些 t 细胞4的再利用。最后, 由于灵敏度较低, 通常需要将这两种技术结合起来才能进行抗原特定的枚举。

为了解决这些问题, 我们开发了基于磁性纳米粒子的人工抗原呈现细胞 (aAPC)5,6,7,8。aAPC 可以功能化与抗原特异性信号肽加载主要组织相容性复合体 (pmhc) 和共同刺激分子-例如, 抗 cd28抗体既丰富抗原特异性 t 细胞, 然后随后刺激它们的扩张 (图 1)。因此, 这些颗粒可以是一种经济高效的现成产品, 既可以定制, 以满足抗原特定的刺激, 但在实验和患者之间实现标准化。执行富集和膨胀过程可使抗原特异性 cd8 + t 细胞膨胀数到千倍, 并可在短短一周内将频率提高到 60%, 从而实现大型 cd8 + t 细胞的表征或治疗使用。细胞的数量。本文介绍了纳米粒子 aAPCs 的制备方法, 在选择纳米粒子性能时的一些关键设计考虑因素, 并展示了利用这些粒子分离和扩展稀有抗原特异性 cd8 + t 细胞的一些典型结果。

Protocol

所有老鼠都按照约翰·霍普金斯大学机构审查委员会批准的指导方针进行维护。 1. 负载二聚类主要组织相容性复合免疫球蛋白融合蛋白 (mhc-ig) 与所需的抗原肽序列。 注: 如果使用 h-2: ig, 则按照步骤1.1 中详细介绍的协议进行操作; 如果使用 h-2 k:ig, 请遵循步骤1.1 中详细介绍的协议。如果使用 h-2db:ig, 则按照步骤1.2 中详细介绍的协议进行操作。 将肽?…

Representative Results

为了成功地富集和扩展抗原特异性 t 细胞, 应成功地将含肽的 mhc-ig 和共刺激分子附着在 aAPC 粒子上。基于3种粒子连接方法, 我们为成功的共轭过程结果提供了一些有代表性的数据 (图 5a)。事实上, 如果配体密度太低, 那么在我们的经验中, 抗原特异性 cd8 + t 细胞就不会发生在100纳米以上配体之间的线性间距附近 (图 5b)<sup class="xre…

Discussion

我们创造了一种基于纳米粒子人工抗原呈现细胞 (aAPCs) 的抗原特异性 t 细胞分离技术。纳米粒子 aAPCs 表面含有含肽的 mhc, 可在共同刺激激活的同时, 实现抗原特异性 t 细胞的结合和激活。aAPCs 也是顺磁性的, 因此可以利用磁场来丰富罕见的抗原特异性 t 细胞。我们对纳米颗粒的尺寸、配体密度、配体选择及其对结合、富集、活化和细胞富集的影响等关键特性进行了优化和研究 (补充文件 1-box …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

j. w. h. 感谢约翰·霍普金斯生物技术研究所的 nih 癌症纳米技术培训中心、国家科学基金会研究生研究金 (dge-1232825) 和 arcs 研究金支助基金会。这项工作得到了国家卫生研究院 (p01-a072677、r01-ca108835、r21-c185819)、tedco/to01 创新倡议和库尔特基金会 (jps) 的支持。

Materials

DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

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Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

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