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Bioquímica

Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

Un protocolo detallado para la aplicación de la haga clic en ayuda de química RNA interactoma estrategia de captura (CARIC) para identificar proteínas de enlace de codificación de ambas y los RNAs se presenta.

Abstract

Una completa identificación de proteínas de unión a RNA (restrictivas) es clave para entender la red de regulación postranscripcional en las células. Una estrategia ampliamente utilizada para la captura RBP explota la poliadenilación [poly(A)] de RNAs de destino, que ocurre sobre todo en eukaryotic mRNAs maduros, dejando la mayoría proteínas de non-poly(A) RNAs no identificados. Aquí describimos los procedimientos detallados de un método reciente denominado haga clic en ayuda de química RNA interactoma captura (CARIC), que permite la captura de todo el transcriptoma de poly(A) y non-poly(A) restrictivas combinando el etiquetado metabólico de RNAs en vivo UV Cross-linking y etiquetado bioorthogonal.

Introduction

El genoma humano se transcribe en distintos tipos de codificación y noncoding RNAs (ncRNAs), incluyendo mRNAs, rRNAs y tRNAs, ARNs nucleares pequeños (snRNAs), RNAs nucleolares pequeño (ARNnop ‘ s) y largo no-codificación RNAs (lncRNAs)1. La mayoría de estos RNAs posee ropa de prácticas comerciales restrictivas y funciona como ribonucleoproteína partículas (RNPs)2. Por lo tanto, una identificación integral de prácticas comerciales restrictivas es un prerrequisito para la comprensión de la red reguladora entre RNAs y prácticas comerciales restrictivas, que está implicada en varias enfermedades humanas3,4,5.

Los últimos años han sido testigos de un gran refuerzo de prácticas comerciales restrictivas en varios sistemas eucariotas2,6, incluyendo humano7,8,9,10,11, ratón12,13,14, levadura9,15,16, pez cebra17, Drosophila melanogaster18,19 , Elegans de Caenorhabditis16, thaliana de Arabidopsis20,21,22y23,de parásitos humanos24,25 . Estos avances se han facilitado por una estrategia de captura RBP desarrollada por Castello et al. 7 y Baltz et al. 8 en el 2012, que combina en vivo UV Cross-linking de RNA y sus proteínas interactuantes, captura de oligo(dT) de poly(A) RNAs y espectrometría de masas (MS)-basado en perfiles proteómicos. Sin embargo, dado el hecho de que poly(A) existe sobre todo en los mRNAs maduros, que cuenta para solamente ~ 3-5% de los eucariotas transcriptoma26, esta estrategia ampliamente utilizada no es capaz de capturar restrictivas interactuando con non-poly(A) RNAs, incluyendo la mayoría ncRNAs y pre-mRNAs.

Aquí, Divulgamos los procedimientos detallados de una estrategia desarrollada recientemente para la captura de todo el transcriptoma de prácticas comerciales restrictivas de poly(A) y non-poly(A)27. Denomina CARIC, esta estrategia combina en vivo UV Cross-linking y el etiquetado metabólico de RNAs con photoactivatable y “clickable” nucleósidos análogos (que contienen un grupo funcional de bioorthogonal que participan en la reacción de clic), 4 – thiouridine (4SU) y 5-ethynyluridine (UE). Pasos que son claves para obtener resultados ideales con la estrategia de CARIC son etiquetado metabólico eficiente UV Cross-linking y haga clic en la reacción y el mantenimiento de la integridad del RNA. Porque el Cu(I) utilizada como catalizador en la reacción de clic puede causar la fragmentación del ARN, un ligando de Cu(I) que puede reducir la fragmentación de la RNA es esencial. Describimos cómo realizar reacciones eficientes clic en lysates de la célula sin causar grave degradación de RNA.

Aunque RBP captura e identificación de las células HeLa sólo se describe en el presente Protocolo, la estrategia de CARIC puede aplicarse a varios tipos de células y posiblemente a los organismos vivos. Además captura las prácticas comerciales restrictivas, este protocolo también proporciona procedimientos paso a paso ágil para preparación de muestras de MS y proteína identificación y cuantificación, que puede ser útil para aquellos que no están familiarizados con los experimentos de la proteómica.

Protocol

PRECAUCIÓN: Cuando sea aplicable, los reactivos usados deben comprar en forma de libre de Rnasa, o disuelto en libre de Rnasa, solventes (para la mayoría de los casos, en dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada). Al manipular las muestras de RNA y reactivos libres de Rnasa, siempre use guantes y máscaras y cambiarlos frecuentemente para evitar la contaminación de la Rnasa. 1. preparación de lisado de etiquetado metabólico y las células reticuladas UV Incorporación m…

Representative Results

Se presentan los resultados representativos de pasos de control de calidad. Los resultados incluyen figuras de análisis en gel fluorescencia descrito en el paso 2.3.2 (figura 1), el análisis de western blot que se describe en el paso 4.1.3 (figura 2A) y el análisis de coloración de plata que se describe en el paso 4.2.2 (figura 2B). Las medidas de control de calidad son críticas para la optimiza…

Discussion

El mantenimiento de la integridad de RNA Feria es una de las claves del éxito experimentos CARIC. Con ligandos apropiados de Cu(I) y cuidado, degradación de RNA puede reducirse significativamente, aunque se observó degradación parcial. La sustitución de la UE y 4SU en muestras experimentales son 1.18% y 0,46%, respectivamente (datos no mostrados). Para RNAs intactos con una longitud de 2.000 nt, ~ 90% de los ARN contienen por lo menos un UE y uno 4SU. Para RNAs parcialmente degradados con una longitud de 1.000 nt, ~…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China becas 91753206, 21425204 y 21521003 y por la nacional clave de investigación y proyecto de desarrollo 2016YFA0501500.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
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Referencias

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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
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