Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione
Summary
Un protocollo dettagliato per l’applicazione di cattura (CARIC) del RNA-Interactoma di chimica-assistita clicca strategia per identificare proteine leganti alla codificazione di entrambi e non codificanti RNA è presentato.
Abstract
Una completa identificazione di RNA-binding proteins (RBPs) è la chiave per comprendere la rete di regolamentazione post-trascrizionale in cellule. Una strategia ampiamente utilizzata per la cattura RBP sfrutta la poliadenilazione [poli (a)] di RNA bersaglio, che si verifica principalmente su mRNA maturo eucariotico, lasciando la maggior parte delle proteine leganti di non-poly(A) RNA non identificato. Qui descriviamo le procedure dettagliate di un metodo recentemente segnalato chiamato click chimica-assistita RNA-Interactoma acquisire (CARIC), che consente di acquisire tutto il trascrittoma RBPs sia poli (a) e non-poly(A) combinando l’etichettatura metabolica del RNA, in vivo UV cross-linking e bioorthogonal tagging.
Introduction
Il genoma umano è trascritto in vari tipi di RNA codificanti e non codificanti (ncRNAs), tra cui mRNA, rRNA, tRNA, piccole molecole di RNA nucleare (snRNAs), piccole molecole di RNA nucleolare (snoRNAs) e lungo non-codificazione RNAs (lncRNAs)1. La maggior parte di questi RNA possiedono abbigliamento di RBPs e funzionare come ribonucleoproteina particelle (RNP)2. Pertanto, una completa identificazione di RBPs è un prerequisito per la comprensione della rete regolamentare tra RNAs e RBPs, che è implicata in varie malattie umane3,4,5.
Ultimi anni hanno testimoniato una grande spinta di RBPs scoperto in vari sistemi eucariotici2,6, compresi umano7,8,9,10,11, del mouse12,13,14, lievito9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22e parassiti umani23,24,25 . Questi progressi hanno stati facilitati da una strategia di acquisizione RBP sviluppata da Castello et al. 7 e Baltz et al. 8 nel 2012, che combina in vivo UV cross-linking di RNA e di proteine interagenti, oligo (distacco) acquisizione di poli (a) RNAs e spettrometria di massa (MS)-base di analisi proteomica. Tuttavia, dato il fatto che poli (a) principalmente esiste il mRNA maturo, che rappresentano solo ~ 3% – 5% del trascrittoma eucariotiche26, questa strategia ampiamente utilizzata non è in grado di catturare RBPs interagendo con non-poly(A) RNAs, tra cui la maggior parte dei ncRNAs e pre-mRNA.
Qui, segnaliamo le procedure dettagliate di una strategia sviluppata di recente per la cattura di tutto il trascrittoma di poli (a) sia non-poly(A) RBPs27. Definito CARIC, questa strategia combina in vivo UV cross-linking ed etichettatura metabolica di RNA con fuse e “cliccabili” analoghi nucleosidici (che contengono un gruppo funzionale di bioorthogonal che possono partecipare clicca reazione), 4 – thiouridine (4SU) e 5-ethynyluridine (UE). Passaggi chiave per ottenere risultati ideali con la strategia di CARIC sono efficienti etichettatura metabolica, reazione di cross-linking e fare clic su UV e il mantenimento dell’integrità di RNA. Perché cu (i) usato come catalizzatore nella reazione di clic può causare la frammentazione degli RNA, un ligando di Cu (i) che può ridurre la frammentazione di RNA è essenziale. Descriviamo come eseguire clic efficienti reazioni in lisati cellulari senza causare grave degradazione del RNA.
Anche se catturare RBP e identificazione in cellule HeLa è descritto solo in questo protocollo, la strategia di CARIC può essere applicata a vari tipi di cellule e possibilmente agli organismi viventi. Oltre alla cattura RBP, questo protocollo fornisce anche razionalizzato le procedure dettagliate per la preparazione del campione di MS e proteina identificazione e quantificazione, che può essere utile per coloro che non hanno familiarità con gli esperimenti di proteomica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il mantenimento dell’integrità di RNA fiera è una delle chiavi del successo esperimenti CARIC. Con appropriati ligandi di Cu (i) e funzionamento attento, degradazione del RNA può essere significativamente ridotto, sebbene degradazione parziale è stata osservata. I rapporti di sostituzione dell’UE e 4SU in campioni sperimentali sono 1,18% e 0,46%, rispettivamente (dati non mostrati). Per RNA intatto con una lunghezza di 2.000 nt, ~ 90% di RNA contengono almeno un UE e uno 4SU. Per RNAs parzialmente degradato con una l…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation di Cina sovvenzioni 91753206, 21425204 e 21521003 e di National Key Research and Development Project 2016YFA0501500.
Materials
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
| Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
| LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
| Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
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