Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)
Summary
Um protocolo detalhado para a aplicação a clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC) estratégia para identificar proteínas obrigatório para ambos os de codificação e não-codificante RNAs é apresentado.
Abstract
Uma abrangente identificação das proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) é a chave para entender a rede reguladora posttranscriptional nas células. Uma estratégia amplamente utilizada para a captura de RBP explora a poliadenilação [poli] de RNAs de alvo, que ocorre principalmente em eucarióticos mRNAs maduros, deixando a maioria das proteínas de ligação de non-poly(A) RNAs não identificado. Aqui descrevemos os procedimentos detalhados de um método recentemente relatado denominado clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC), que permite a captura de todo o transcriptoma do RBPs tanto poli e non-poly(A) combinando a rotulagem metabólica do RNAs, na vivo UV do cross-linking e opaco de marcação.
Introduction
O genoma humano é transcrito em vários tipos de codificação e não-codificante RNAs (ncRNAs), incluindo os mRNAs, rRNAs, os tRNAs, pequenos RNAs nucleares (snRNPs), pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) e tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs)1. A maioria destes RNAs possuem roupas de RBPs e funciona como ribonucleoprotein partículas (RNPs)2. Portanto, uma identificação abrangente do RBPs é um pré-requisito para a compreensão da rede regulamentar entre RNAs e RBPs, que está implicada em várias doenças humanas3,4,5.
Nos últimos anos têm testemunhado um grande impulso de RBPs, descoberto em vários sistemas eukaryotic2,6, incluindo humano7,8,9,10,11, rato12,13,14, fermento9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22e parasitas humanos23,24,25 . Estes avanços têm sido facilitados por uma estratégia de captura RBP desenvolvida pela Castello et al 7 e Baltz et al 8 em 2012, que combina na vivo UV do cross-linking de RNA e sua interação proteínas, oligo (descolamento) captura de RNAs poli (a) e espectrometria de massa (MS)-com base em perfis de proteomic. No entanto, dado o fato de que poli existe principalmente em mRNAs maduros, que são responsáveis por apenas ~ 3-5% de eukaryotic transcriptome26, esta estratégia amplamente utilizada não é capaz de capturar RBPs interagindo com non-poly(A) RNAs, incluindo a maioria de ncRNAs e pré-mRNAs.
Aqui, nós relatamos os procedimentos detalhados de uma estratégia desenvolvida recentemente para a captura de todo o transcriptoma de tanto poli e non-poly(A) RBPs27. Denominado CARIC, esta estratégia combina na vivo UV do cross-linking e rotulagem metabólicos de RNAs com photoactivatable e “clicáveis” análogos nucleosídeos (que contêm um grupo funcional opaco que podem participar na reação de clique), 4 – thiouridine (4SU) e 5-ethynyluridine (UE). Etapas que são a chave para obter resultados ideais com a estratégia CARIC são eficiente rotulação metabólica, cross-linking e clique em reacção à luz UV e a manutenção da integridade do RNA. Porque Cu(I) usado como catalisador na reação de clique pode causar fragmentação dos RNAs, um ligante de Cu(I) que pode reduzir a fragmentação de RNA é essencial. Descrevemos como realizar reações eficiente clique no lisados celulares sem causar grave degradação do RNA.
Embora RBP captura e identificação em células HeLa só é descrita no presente protocolo, a estratégia CARIC pode ser aplicada para vários tipos de células e, possivelmente, de organismos vivos. Além de captura RBP, este protocolo também fornece procedimentos passo a passo simplificados para preparação de amostras de MS e proteína identificação e quantificação, que pode ser útil para aqueles que não estão familiarizados com os experimentos de proteomic.
Protocol
Representative Results
Discussion
A manutenção da integridade de RNA justa é uma das chaves para experiências bem sucedidas de CARIC. Com ligantes apropriadas de Cu(I) e operação cuidadosa, degradação de RNA pode ser significativamente reduzida, embora tenha sido observada degradação parcial. As taxas de substituição da UE e 4SU em amostras experimentais são 1,18% e 0,46%, respectivamente (dados não mostrados). Para RNAs intactas com um comprimento de 2.000 nt, ~ 90% de RNAs conter pelo menos um da UE e um 4SU. Para parcialmente degradadas …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo nacional ciências naturais Fundação de China bolsas 91753206, 21425204 e 21521003 e pelo nacional chave de pesquisa e desenvolvimento do projeto 2016YFA0501500.
Materials
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
| Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
| LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
| Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
Referencias
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
- Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
- Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
- Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
- Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
- Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
- Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
- Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
- Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
- Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
- Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
- Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
- Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
- Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
- Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
- Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
- Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
- Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
- Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).
