Summary

異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + T 細胞活性化のための加工

Published: October 12, 2018
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Summary

ここでは、迅速かつ再現性をもって生物学的に促された、生分解性のバスユニットなど抗原提示し、可変サイズ、形状、および T 細胞の拡大前のヴィヴォまたは体内表面蛋白質プレゼンテーションと細胞 (aAPC) を生成するためのプロトコルを提案します。.

Abstract

人工抗原提示細胞 (aAPC) は、T 細胞を刺激するために強力な能力による免疫変調の有望なプラットフォームです。無細胞基板は、信号プレゼンテーション パラメーターの正確な制御と T 細胞との相互作用を調節する aAPC 表面の物理的性質などを含む細胞ベースの aAPC 上重要な利点を提供しています。異方性粒子から構成されて aAPC 特に楕円体粒子結合の増加と T 細胞の大きい表面積のための刺激的な T 細胞の球形対応連絡先としてもより効果的であることが示されています。非特異的取り込みと強化された薬物動態特性を減少。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず実装および再現性をもって使用する薄膜のストレッチが困難になるなど、異方性粒子を生成する方法をも広く受け入れ。

このため、我々 は可変のサイズ、形状を持つ生分解性異方性粒子ベース aAPC の急速な標準化された作製のためのプロトコルを記述して T 細胞拡張前のヴィヴォまたは生体内で、方法と一緒にプレゼンテーションを信号サイズ、形態、およびコンテンツ、表面蛋白質を特徴付けるその機能を評価します。異方性 aAPC の製造へのこのアプローチは、スケーラブルかつ再現可能な作って、aAPC「市販」免疫療法のための生成に理想的です。

Introduction

彼らは堅牢な抗原特異的 T 細胞応答を生成できるため、人工抗原提示細胞 (aAPC) は免疫調節剤として約束を示しています。これらのプラットフォームに不可欠な効率的に T 細胞の活性化のための重要な信号を提示するという機能です。容易で安価を作製、スケール アップと翻訳の間に少ない課題に直面し、細胞ベースの治療に関連付けられているリスクを軽減するため、無細胞 aAPC、セルベース aAPC に魅力的な代替手段です。無細胞 aAPC は信号プレゼンテーション パラメーター制御の高度と T セル1に接続されます。 表面の物理的性質を有効にできます。

aAPC は、T 細胞の活性化に不可欠な 2 つの信号の最小値を要約する必要があります。シグナル 1 は、抗原認識を提供し、T 細胞受容体 (TCR) を認識し、MHC クラス I または II の同種の抗原を軸受を介して複雑な TCR シグナリングで最高潮に達する従事し場合に発生します。抗原特異性要件をバイパスするには、aAPC システムはしばしば特異的 TCR 複合体を刺激する CD3 受容体に対するアゴニスト抗体を負担します。MHC、特に MHC 多量の組換えの形態は、抗原特異性2,3を提供するために、aAPC の表面に使用されています。信号 2 は T 細胞の活動を指示する共刺激シグナルです。共刺激が引き起こす T 細胞の活性化に必要なを提供するために 4-1 bb など他の共刺激受容体が正常にターゲットを絞った4をされているが、CD28 受容体は一般的に aAPC 表面アゴニスト抗体で刺激されます。1 と 2 の信号タンパク質 aAPC を合成する剛体粒子の表面に通常固定されています。歴史的に、aAPC はポリスチレンの45と鉄デキストラン6を含む、材料の様々 なでつくられています。新しいシステムは利用するポリ (乳酸グリコール酸) のような生分解性ポリマー (PLGA) aAPC 蛋白質に信号を簡単に結合することができます、生体内直接管理に適しているとの持続的な放出を促進することができますを生成するにはサイトカインや可溶性因子 T 細胞活性化78を強化するためにカプセル化されます。

必要な信号蛋白質の存在に加え aAPC/T 細胞間相互作用の中に十分に大きい面積で受容体関与は T 細胞の活性化に不可欠です。したがって、aAPC のサイズや形状などの物理的なパラメーターを大幅にその接触面積を変更し、T 細胞を刺激するために彼らの能力に影響を与えます。ミクロン サイズ aAPC 刺激 T 細胞で、ナノスケールの対応9,10よりも効果的であることが示されています。しかし、ナノ aAPC は優れた体内分布および可能性があります、パフォーマンス強化体内にマイクロ aAPC11リンパ節よりよい排水を持つことができます。形状は、aAPC の粒子ベース システムへの関心の別の変数です。異方性 aAPC は最近刺激 T 細胞, と標的細胞の減らされた非特異的細胞取り込みと相まって強化された相互作用による主に等方性粒子よりもより効果的に示されています。細胞は優先的に楕円体粒子の長軸をバインドし、平坦なサーフェスの曲率半径を大きく aAPC と T 細胞の12のより多くの接触を可能にします。楕円体粒子の長軸は、貪食能、次の体内管理12,13球状粒子と比較して高められた循環時間の結果を落胆させます。これらの利点のため楕円体粒子仲介抗原特異的 T 細胞体外体内の球形の粒子と比較しての拡大効果は観測マイクロおよびナノスケールの回路の両方で12 13。異方性粒子を製造するための様々 な戦略がありますが、多様な粒子形状14の範囲を生成するために使用シンプルで広く受け入れられている方法は、薄膜のストレッチします。次の合成、粒子は映画にキャスト、粒子材料のガラス転移温度以上の温度で 1 つまたは 2 つの次元で伸びる。フィルム粒子を取得するために溶かします。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず加工粒子ベース aAPC の現在のアプローチは等方性システムに制限されてほとんどと粒子形状を変更する方法は、実装が困難な特定 aAPC 合成と互換性がありません。戦略と精度と再現性の欠如15。当社の薄膜のストレッチ法は、手動で実行または急速に様々 な生分解性高分子から合成される異方性粒子を生成するための自動化された方法で 1 つまたは 2 つの次元のための15で必要な縦横比に拡大できます。

生分解性の粒子ベースのアプローチで急速に aAPC 可変サイズと形状を生成する T 細胞の拡大前のヴィヴォまたはのための標準化された方法でスケーラブルな薄膜ストレッチ技術と相まって開発した従来の仕事に基づいて、vivo。この aAPC システムに高度な柔軟性を与える目的の密度の粒子表面にカルボキシル基と関心の任意の蛋白を結合する蛋白質活用戦略を使用できます。サイズ、形態、表面蛋白質、aAPC のコンテンツを評価し、その機能の in vitro評価法についても述べる。このプロトコルは、展開前のヴィヴォ免疫細胞や生体内でさまざまな免疫療法のアプリケーションのために容易に適応することができます。

Protocol

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョンズ ・ ホプキンス大学のによって承認されています。 1. 可変サイズの球形の PLGA 粒子の作製 微粒子の合成のための材料の準備 W/w ポリビニル アルコール (PVA) の 5% 溶液を準備します。 磁気攪拌棒三角フラスコに 500 mL の純水 (DI) を追加、500 rpm とモニター温ホット プレー?…

Representative Results

ストレッチ装置自動 2次元薄膜の回路図は、図 1で与えられます。Ho ら17標準加工と加工技術を使用してアルミ部品から担架を構築で回路図と 1 D 薄膜デバイスのストレッチの説明を与えます。1 D 担架と同様に、2 D の担架は金属のグリップとガイド レールで構成されます。双方向鉛ねじは、回転運動を直線に変換する使用され?…

Discussion

このプロトコルは、異方性高分子粒子の正確な生成のため汎用性の高い方法を詳しく説明します。ここで説明する手法を伸ばして薄い膜がスケーラブルな高い再現性で安価です。異方性粒子を生成するための代替技術はコストが高い、低いスループット、および限られた粒を含む多くの制限に苦しみます。薄膜のアプローチをストレッチは、合成後に異方性粒子が変更されるため有利である?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

EBA (DGE-1746891)、KRR (DGE-1232825) サポートの NSF 大学院研究フェローシップ プログラムをありがとうございます。RAM のおかげで国立研究サービス賞を受賞 NIH NCI F31 (F31CA214147) とサポートの大学科学者フェローシップの成果報酬です。著者に感謝 (R01EB016721 と R01CA195503) の NIH、失明ジェームスの防止およびキャロル無料カタリスト賞、研究サポートのためがん免疫療法のビジネスキャリー ブルームバーグ キンメル所。

Materials

Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed Polysciences, Inc. 02975-500
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Digital Thermometer Fluke N/A Model name: Fluke 52 II
Immersion Temperature Probe Fluke N/A Model name: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & Stirrer Benchmark Scientific H3760-HS
Multipoint stirrer Thermo Fisher Scientific 50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich 719900
Dichloromethane Sigma-Aldrich D65100
Homogenizer IKA  0003725001
Sonicator Sonics & Materials, Inc. N/A Model number: VC 505
Sonicator sound abating enclosure Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0427
Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0220
Sonicator microtip Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0423
High speed centrifuge Beckman Coulter N/A Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP
High speed centrifuge rotor Beckman Coulter 369691 Model number: JA-17
High speed polycarbonate centrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 mL, screw cap
Rectangular disposable petri dish VWR International 25384-322 75 x 50 x 10 mm
Square disposable petri dish VWR International 10799-140 100 mm x 100 mm
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody Biolegend 100314
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 Bio X Cell BE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt Sigma-Aldrich 56485
MES Sigma-Aldrich M3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100212
APC anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102109
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate Sigma-Aldrich CLS3915 flat bottom, black polystyrene
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11875093
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135 Heat Inactivated, sterile-filtered
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) Biolegend 589102
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
MEM Vitamin Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11120052
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotech 130-104-075
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher Scientific C34554
LS Columns Miltenyi Biotech 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS Multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
Flow Cytometer Accuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader BioTek
autoMACS Running Buffer Miltenyi BIotech 130-091-221
Cell Strainer ThermoFisher Scientific 22363548 Sterile, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing Buffer ThermoFisher Scientific A1049201
C57BL/6J (Black 6) Mouse The Jackson Laboratory 000664 Male, at least 7 weeks old
U-Bottom Tissue Culture Plates VWR 353227 Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates
40 V DC Power Supply Probotix LPSK-4010
PTFE Coated Wire Mouser 602-5858-100-01 This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work
Stepper Motor Driver Probotix MondoStep5.6
IDC Connector Kit Probotix IDCM-10-12
Microcontroller Probotix PBX-RF
4A Fuses Radio Shack 2701026 Equivalent fuses will work as well
DB25 Male to Male Cable Probotix DB25-6
USB-A to USB-B Cable Staples 2094915 Equivalent cable will work as well
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female Mouser 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S
Stepper Motor Probotix HT23-420-8
Right Hand Lead Screw Roton 60722
Left Hand Lead Screw Roton 60723
Screws McMaster Carr 92196A151
Neoprene Rubber McMaster Carr 8698K51
Right Handed Flanged Lead Nut Roton 91962
Left Handed Flanged Lead Nut Roton 91963
Linux Control Computer Probotix LCNC-PC Any computer with matching specification and Linux operating system will work
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 % ThermoFisher Scientific 15250061

Referencias

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Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, R. A., Green, J. J. Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation. J. Vis. Exp. (140), e58332, doi:10.3791/58332 (2018).

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