Изготовление анизотропной полимерного искусственного антиген представляющих клеток для CD8 + Т-клеток активации

Искусственные антиген представляющих клеток (aAPC) показали обещание как иммуномодулирующих агентов, потому что они могут генерировать ответ надежные антиген специфические Т-клеток. Важное значение для этих платформ являются их способность эффективно представит решающую сигналов для активации Т-клеток. Бесклеточной aAPC являются привлекательной альтернативой на основе ячеек aAPC, потому что они легче и дешевле в изготовлении, сталкиваются с меньшими проблемами во время масштабирования и перевод и смягчить риски, связанные с лечения на основе ячеек. Бесклеточной aAPC также обеспечить высокую степень контроля над представления параметров сигнала и физические свойства поверхности, которая будет взаимодействовать с клетками T¹.

aAPC должны охарактеризовать как минимум двух сигналов, необходимых для активации Т-клеток. Сигнал 1 обеспечивает антигены и происходит, когда Т-клеточных рецепторов (TCR) признает и осуществляет взаимодействие с MHC класса I или II, с учетом его родственных антигена, кульминацией сигнализации через TCR комплекс. Чтобы обойти требование конкретизации антигена, aAPC систем часто несут агонистических моноклональные антитела против CD3-рецептор, который nonspecifically стимулирует TCR комплекс. Рекомбинантные формы MHC, особенно MHC мультимеры, также используются на поверхности aAPC предоставлять антигена специфика^2,3. Сигнал 2 это костимуляторных сигнал, который направляет деятельность Т-клеток. Предоставлять костимуляции, необходимые для активации клеток T, рецептор CD28 обычно стимулируется с агонистических антитела представлены на поверхности aAPC, хотя другие костимуляторных рецепторов, таких как 4-1BB были успешно целевых⁴. Сигнал 1 и 2 белки обычно лишенных подвижности на поверхности жестких частиц синтезировать aAPC. Исторически aAPC были изготовлены из различных материалов, в том числе полистирола^4,5 и Железо декстран⁶. Новые системы используют биоразлагаемые полимеры как поли (молочно co гликолевая кислота) (PLGA) для создания aAPC, который может легко сочетаться сигнал белки, подходят для прямого управления в естественных условияхи могут облегчить стабильного выпуска инкапсулированные цитокинов или растворимых факторов для расширения Т-клеток активации^7,8.

В дополнение к наличие необходимых сигналов белков рецептор взаимодействие через достаточно большой площади поверхности во время взаимодействия клеток aAPC/T имеет важное значение для активации клеток T. Таким образом физические параметры aAPC, такие как размер и форма резко изменить их доступных площадь контакта и влияет на их способность стимулировать клетки T. Микронных размеров aAPC показали должна быть более эффективной в стимулировании Т-клеток, чем их коллеги наноразмерных^9,10. Однако нано aAPC может иметь Улучшенный накопление и лучше дренаж на лимфатические узлы, которые могут повысить их производительность в vivo над микро aAPC¹¹. Форма является другой переменной интерес в системах на основе частиц aAPC. Анизотропные aAPC недавно было показано, быть более эффективным, чем изотропной частиц на стимулирование Т-клеток, главным образом благодаря укреплению взаимодействия с сочетании с снижение неспецифической клеток поглощения клеток-мишеней. Клетки преференциально связывают к длинной оси эллипсоидальными частицами, и больший радиус кривизны и плоской поверхности позволяют больше контакта между aAPC и¹²Т-клеток. Длинная ось эллипсоидальными частицами также препятствует фагоцитоза, что приводит к времени увеличенная циркуляция, по сравнению с сферических частиц, следуя в естественных условиях администрации^12,13. Учитывая все эти преимущества эллипсоидальными частицами посредником большее расширение антиген специфические T клетки в пробирке и в естественных условиях по сравнению с сферических частиц, эффект наблюдается как микро, так и nanoscales^{12, 13}. Существуют различные стратегии для изготовления анизотропной частицы, но тонкопленочных растяжения является простым, широко признанным метод, используемый для создания целого ряда различных частиц формы¹⁴. После синтеза частицы брошен в фильмах и растягивается в одном или двух измерениях при температуре выше температуры стеклования частиц материала. Затем фильм растворяется для извлечения частиц. Несмотря на растущий интерес к анизотропной частиц, текущие подходы для изготовления на основе частиц aAPC в основном ограничиваются изотропной систем и методы изменения формы частиц может быть трудно осуществить, несовместимые с определенным aAPC синтез стратегии и отсутствие точности и воспроизводимости¹⁵. Нашу технику растяжения тонкопленочных может быть выполнена вручную или в автоматическом режиме быстро сформировать анизотропной частицы, синтезированных из целого ряда биоразлагаемых полимеров, растягивается до желаемой пропорции в один или два размеры¹⁵.

Основываясь на нашей предыдущей работы, мы разработали биологически подход на основе частиц, в сочетании с масштабируемой растяжения тонкопленочной технологии быстро генерировать aAPC с перестраиваемой размер и форму в стандартизованном виде для Т-клеток расширения ex vivo или в VIVO. Наша стратегия спряжение белка может использоваться для пара любые белки интерес к карбоксильных групп на поверхности частиц на желаемой плотности, давая этой системы aAPC высокую степень гибкости. Мы также описывают методы характеризуют размер, морфология и поверхностных белков содержание aAPC и оценить их функциональность в пробирке. Этот протокол может быть легко адаптирована для расширения иммунные клетки ex vivo или в естественных условиях для различных иммунотерапевтических приложений.