Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Kunstmatige antigeen voorstellende cellen (aAPC) is gebleken belofte als immunomodulerende agenten omdat ze een robuuste antigeen-specifieke T cel-reactie kunnen genereren. Essentieel voor deze platforms zijn hun mogelijkheid om efficiënt cruciale signalen voor T-cel activatie. Acellulair aAPC zijn een aantrekkelijk alternatief voor cel-gebaseerde aAPC, omdat ze gemakkelijker en goedkoper te fabriceren, minder uitdagingen tijdens schaalvergroting en vertaling, en risico’s van cel-gebaseerde therapieën te verlichten. Acellulair aAPC is ook voorzien van een hoge mate van controle over signaal presentatie parameters en fysieke eigenschappen van het oppervlak zal interfacecomponenten met T cellen¹.

aAPC moet een minimum van twee signalen essentieel voor T-cel activatie recapituleren. Signaal 1 biedt antigeen erkenning en treedt op wanneer de T cel receptor (TCR) herkent en houdt zich bezig met een MHC klasse I of II, rekening houdend met zijn cognaat antigeen, culminerend in de signalering via de TCR complexe. Om te omzeilen het vereiste antigeen specificiteit, dragen aAPC systemen vaak een agonistic monoklonaal antilichaam tegen de CD3 receptor, dat nonspecifically de TCR-complex stimuleert. Recombinante vormen van MHC, met name MHC multimeren, hebben ook gebruikt op het oppervlak van aAPC antigeen specificiteit^2,3. Signaal 2 is een costimulatory signaal dat T cel activiteit regisseert. Om de costimulatie die nodig zijn voor de T-cel activatie, wordt de CD28 receptor in het algemeen gestimuleerd met een agonistic antilichaam gepresenteerd op het oppervlak van de aAPC, hoewel andere costimulatory receptoren zoals 4-1BB met succes gerichte^{4 geweest}. Signaal 1 en 2 eiwitten zijn meestal geïmmobiliseerd op het oppervlak van stijve deeltjes te synthetiseren van aAPC. Historisch gezien hebben aAPC is vervaardigd uit een verscheidenheid aan materialen, met inbegrip van polystyreen^4,5 en ijzer dextran⁶. Nieuwere systemen gebruiken biologisch afbreekbare polymeren zoals poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) voor het genereren van aAPC die gemakkelijk kan worden gekoppeld om aan te geven van eiwitten, geschikt voor directe toediening in vivo, en kan vergemakkelijken de aanhoudende release van ingekapseld cytokines of oplosbare factoren om uit te breiden van T cel activatie^7,8.

Naast de aanwezigheid van eiwitten van de nodige signaal is betrokkenheid van de receptor over een voldoende groot oppervlak tijdens de interactie die aAPC/T cel essentieel voor T-cel activatie. Fysieke parameters van de aAPC zoals grootte en vorm drastisch veranderen hun beschikbare contactpunten en dus invloed hebben op hun vermogen te stimuleren van T-cellen. Micron en middelgrote aAPC gebleken om meer effectief op stimulerende T-cellen dan hun nanoschaal tegenhangers^9,10. Nano-aAPC kan echter superieur ook en betere afvoer naar de lymfeklieren die hun prestaties in vivo over micro-aAPC^{11 verbeteren kunnen}. Vorm is een andere variabele van belang in aAPC deeltje gebaseerde systemen. Anisotrope aAPC hebben onlangs aangetoond dat effectiever dan isotrope deeltjes op stimulerende T-cellen, voornamelijk als gevolg van verbeterde interactie met de doelcellen in combinatie met verminderde aspecifieke cel opname. Cellen bij voorkeur binden aan de lange as van de ellipsvormige deeltjes, en de grotere straal van kromming en platter oppervlak zorgen voor meer contact tussen de aAPC en de T cel¹². De lange as van de ellipsvormige deeltjes ook ontmoedigt fagocytose, wat resulteert in verhoogde omloop tijd in vergelijking met bolvormige deeltjes na in vivo administratie^12,13. Vanwege deze voordelen bemiddelen ellipsvormige deeltjes grotere uitbreiding van antigeen-specifieke T cellen in vitro es in vivo in vergelijking met bolvormige deeltjes, een effect waargenomen bij zowel de micro- en nanoscales^{12, 13}. Er zijn verschillende strategieën te fabriceren anisotrope deeltjes, maar dunne-film uitrekken zich is een eenvoudige, algemeen aanvaarde methode gebruikt voor het genereren van een aantal uiteenlopende particle vormen¹⁴. Na de synthese, zijn de deeltjes in films geworpen en uitgerekt in één of twee dimensies bij een temperatuur boven de temperatuur van de overgang glas van het deeltje materiaal. De film wordt dan opgelost om op te halen van de deeltjes. Ondanks de groeiende belangstelling voor anisotropische deeltjes, kunnen huidige benaderingen voor vervaardigen deeltje gebaseerde aAPC zijn meestal beperkt tot isotrope systemen en methoden voor het wijzigen van de particle shape moeilijk uit te voeren, onverenigbaar is met de synthese van bepaalde aAPC strategieën, en gebrek aan nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid¹⁵. Onze uitrekkende techniek van dunne-film kan handmatig worden uitgevoerd of op een geautomatiseerde wijze snel genereren anisotrope deeltjes uit een verscheidenheid van biologisch afbreekbare polymeren gesynthetiseerd, uitgerekt tot een gewenste hoogte-breedteverhouding in één of twee afmetingen¹⁵.

Op basis van onze eerdere werk, ontwikkeld we een biologisch afbreekbaar deeltje gebaseerde aanpak in combinatie met schaalbare dunne-film uitrekkende technologie om snel genereren aAPC met regelbare grootte en vorm op een gestandaardiseerde manier voor T cel expansie ex vivo of in vivo. Onze eiwit-vervoeging-strategie kan worden gebruikt voor elke expressie gebrachte eiwitten van belang aan carboxylgroepen op het oppervlak van de deeltjes op een gewenste dichtheid, een hoge mate van flexibiliteit te geven aan dit aAPC-systeem koppelen. Ook beschrijven we methoden voor het karakteriseren van de grootte, morfologie en oppervlakte-proteïne inhoud van aAPC, en hun functionaliteit in vitrote evalueren. Dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden aan immuuncellen ex vivo of in vivo voor allerlei immunotherapeutische toepassingen uit te breiden.