Summary

Neurogenesi con cellule carcinoma embrionale P19

Published: April 27, 2019
doi:

Summary

La linea cellulare del carcinoma embrionale del topo P19 (linea cellulare P19) è ampiamente utilizzata per studiare il meccanismo molecolare della neurogenesi con grande semplificazione rispetto all’analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo per la neurogenesi indotta da acido retinoico nella linea cellulare P19.

Abstract

La linea cellulare P19 derivata da un teratocarcinoma derivato da un embrione di topo ha la capacità di differenziarsi nei tre strati germinali. In presenza di acido retinoico (RA), la linea cellulare P19 coltivata in sospensione è indotta a differenziarsi in neuroni. Questo fenomeno è ampiamente studiato come un modello di neurogenesi in vitro. Pertanto, la linea cellulare P19 è molto utile per gli studi molecolari e cellulari associati alla neurogenesi. Tuttavia, i protocolli per la differenziazione neuronale della linea cellulare P19 descritti nella letteratura sono molto complessi. Il metodo sviluppato in questo studio è semplice e giocherà un ruolo nel chiarire i meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.

Introduction

Durante lo sviluppo embrionale, uno strato a cella singola viene trasformato in tre strati germinali separati1,2,3. Per aumentare le possibilità di ricerca dei fenomeni che si verificano in vivo, la generazione di aggregati tridimensionali (corpi embrionali) è stata sviluppata come un modello conveniente. Gli aggregati cellulari formati in questo modo possono essere esposti a varie condizioni causando differenziazione cellulare, che riflettono lo sviluppo dell’embrione4,5. La linea cellulare p19 murina carcinoma embrionale (linea cellulare P19) è comunemente usata come modello cellulare per studi di neurogenesi in vitro6,7,8. La linea cellulare P19 presenta le caratteristiche tipiche delle cellule staminali pluripotenti e può differenziarsi in neuroni in presenza di acido retinoico (RA) durante l’aggregazione cellulare seguita da escrescenza neurite in condizioni aderenti. Inoltre, la linea cellulare P19 indifferenziata è anche in grado di formare cellule muscolo-e cardiomiociti-come sotto l’influenza di solforo dimetilo (DMSO)9,10,11,12.

Molti metodi13,14,15,16 sono stati segnalati per la differenziazione neuronale, ma la metodologia è a volte complicata e non facile da comprendere leggendo solo le descrizioni. Ad esempio, i protocolli a volte richiedono una combinazione del mezzo DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco,minedante, integrato con una miscela di siero di vitello (CS) e siero bovino fetale (FBS)13. Inoltre, i media utilizzati per lo sviluppo neuronale sono spesso composti da Neurobasal e B27 integratori13,14,15,16. Come tale, i metodi esistenti contengono complessità nella loro preparazione e il nostro obiettivo qui è quello di semplificare i protocolli. In questo studio, abbiamo dimostrato che DMEM con FBS può essere utilizzato per mantenere la linea cellulare P19 (DMEM – 10% FBS) così come per lo sviluppo neuronale (DMEM – 5% FBS – RA). Questo metodo semplificato per la neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 ci permette di studiare il meccanismo molecolare di come vengono sviluppati i neuroni. Inoltre, la ricerca sulle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer è condotta anche utilizzando la linea cellulare P1917,18, e crediamo che il metodo sviluppato in questo studio giocherà un ruolo nel chiarire il meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.

Protocol

1. Manutenzione della cultura Cultura la linea cellulare P19 in Maintenance Medium (il mezzo di Aquila modificato di Dulbecco con 4.500 mg/L di glucosio integrato con 10% FBS, 100 unità / mL penicillina e 100 unità / mL streptomicina). Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2. 2. Cellule sottocoltura Quando le cellule raggiungono circa l’80% di confluenza, rimuovere il mezzo esaurito dai flaconi di coltura cellulare (superficie 25 cm2).</l…

Representative Results

Lo schema semplificato del protocollo per l’induzione della neurogenesi nella linea cellulare P19 è presentato nella Figura 1. Per definire il carattere della linea cellulare P19 in uno stato indifferenziato e durante la neurogenesi, è stato utilizzato il metodo RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). La linea cellulare P19 indifferenziata esprimeva i geni di pluripotenza come cation organica/carnitina trasportatore4 (Oct4) e Omeo…

Discussion

Qui, descriviamo un semplice protocollo per la neurogenesi usando la linea cellulare P19. Anche se molti rapporti sono stati pubblicati a questo proposito, una metodologia dettagliata per l’induzione della neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 rimane poco chiara. Inoltre, abbiamo utilizzato un semplice mezzo DMEM ad alto glucosio (4.500 mg/L) con 10% FBS per l’intero esperimento. Questo ci ha permesso di eseguire l’esperimento neurogenico in modo user-friendly ed espandere l’uso di questo metodo per il futuro.</…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Centro nazionale di scienze, Polonia (n. di sovvenzione. UMO-2017/25/N/N/N-N/3/01886) e KNOW (Leading National Research Centre) Consorzio scientifico “Animale sano – Cibo sicuro”, decisione del Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore n. 05-1/KNOW2/2015

Materials

6x DNA Loading Dye EURx E0260-01
Agarose Sigma- Aldrich A9539
cDNA synthesis kit EURx E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) Sigma- Aldrich 10236276001 Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine Lonza BE12-604Q
Ethanol 99.8% Chempur CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS) EURx E5050-03
MAP2 antibody Thermo Fisher Scientific PA517646 Dilution 1:100
PCR reaction kit EURx E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ Lonza BE17- 517Q
Retinoic acid Sigma- Aldrich R2625-50MG  dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) Thermo Fisher Scientific A11034 Dilution 1:500
Skim milk Sigma- Aldrich 1153630500
TBE Buffer Thermo Fisher Scientific B52
Triton-X 100 Sigma- Aldrich T8787-100ML
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red biosera LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes Profilab 515.01
10 mL Serological Pipettes Profilab 515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture Corning C351029
15 mL centrifuge tubes Sigma- Aldrich CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes Profilab 515.05
6-well plate Corning CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 Sigma- Aldrich CLS430639-200EA

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Leszczyński, P., Śmiech, M., Teeli, A. S., Zołocińska, A., Słysz, A., Pojda, Z., Pierzchała, M., Taniguchi, H. Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (146), e58225, doi:10.3791/58225 (2019).

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