Summary

נוירוגנזה באמצעות P19 Embryonal קרצינומה של תאים

Published: April 27, 2019
doi:

Summary

העכבר P19 מתחלקים קרצינומה של קו התא (קו התא P19) משמש רבות לחקר המנגנון המולקולרי של נוירוגנזה עם פישוט גדול בהשוואה לניתוח vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוירוגנזה הנגרמת חומצה המושרה P19 קו התא.

Abstract

קו התא P19 נגזר העובר העכבר הנגזר teratocarcinoma יש את היכולת להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט. בנוכחות חומצה retinoic (RA), ההשעיה תרבותי P19 קו התא הוא המושרה להבדיל לנוירונים. תופעה זו נחקר בהרחבה כמודל נוירוגנזה בתוך מבחנה. לכן, קו התא P19 הוא מאוד שימושי עבור המחקרים המולקולריים והסלולריים הקשורים נוירוגנזה. עם זאת, פרוטוקולים עבור הבחנה עצבית של קו התא P19 המתואר בספרות הם מורכבים מאוד. השיטה המפותחת במחקר זה פשוטה והיא תשחק תפקיד בהסבר למנגנון המולקולרי בחריגות נוירונטיות ומחלות ניווניות.

Introduction

במהלך embryonal פיתוח, שכבת תא אחת הופכת לשלוש שכבות הנבט הנפרדות1,2,3. כדי להגביר את אפשרויות המחקר של תופעות המתרחשות בvivo, התפתחו הדור של אגרגטים תלת-ממדיים (גופים עובריים) כמודל נוח. אגרגטים סלולריים שנוצרו בדרך זו ניתן לחשוף לתנאים שונים גרימת בידול התא, אשר משקפים את ההתפתחות של העובר4,5. קו קרצינומה עובריים P19 murine (קו תא P19) משמש בדרך כלל כמודל הסלולר ללימודי נוירוגנזה ב מבחנה6,7,8. קו התא P19 מציג תכונות מסוימות של תא גזע בעוצמה pluripotent והוא יכול להבדיל לנוירונים בנוכחות של חומצה retinoic (RA) במהלך צבירת תאים ואחריו neurite מוצלח תחת תנאים חסיד. יתר על כן, קו תא P19 מובחן הוא גם מסוגל להרכיב תאים שרירים וקרדיולציט בדומה תחת השפעת diמתיל סולפוקסיד (dmso)9,10,11,12.

שיטות רבות שונות13,14,15,16 דווחו על בידול עצבי, אבל המתודולוגיה היא לפעמים מסובכת ולא קל לתפוס רק על ידי קריאת התיאורים. לדוגמה, פרוטוקולים דורשים לפעמים שילוב של מדיום הנשר המתוקן של Dulbecco (DMEM) בינוני עם תערובת של סרום עגל (CS) וסרום של שור עוברי (FBS)13. יתרה מזאת, מדיה המשמשת להתפתחות עצבית מורכבת לעתים קרובות מנוירוסיס ותוספי B2713,14,15,16. ככאלה, שיטות קיימות מכילות את המורכבות שבהכנות והמטרה שלנו כאן היא לפשט את הפרוטוקולים. במחקר זה, הדגמנו כי DMEM עם FBS יכול להיות מנוצל עבור שמירה על קו התא P19 (Dמאמ + 10% FBS), כמו גם עבור פיתוח עצבי (DMEM גברת + 5% FBS + RA). זו שיטה פשוטה עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19 מאפשר לנו ללמוד את המנגנון המולקולרי של איך הנוירונים מפותחים. יתר על כן, מחקר על מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר מתנהל גם באמצעות P19 cell קו17,18, ואנו מאמינים כי השיטה שפותחה במחקר זה ישחק חלק בהסבר לצאת ה מנגנונים מולקולריים בחריגות נוירו-התפתחותיות ומחלות ניווניות.

Protocol

1. תחזוקת התרבות תרבות קו התא P19 בינונית תחזוקה (מדיום הנשר שונה של מאוד עם 4,500 mg/L של גלוקוז שיושלם עם 10% FBS, 100 יחידות/מ”ל פניצילין ו 100 יחידות/mL סטרפטומיצין). מודטה ב 37 ° צ’ ו 5% CO2. 2. תאים תת-משניים כאשר התאים מגיעים כ 80% המפגש, להסיר את המדיום המושקע מבחנות תרבות ?…

Representative Results

הערכה פשוטה של פרוטוקול אינדוקציה נוירוגנזה ב P19 קו התא מוצג באיור 1. על מנת להגדיר את האופי של קו התא P19 במצב מובחן ובמהלך נוירוגנזה, RT-PCR (הפוכה שרשרת של תגובת השרשרת) שימוש. קו התאים P19 מובחן הביע את גנים הפלדה כגון קטיון אורגני/carnitine transporter4 (Oct4) ו nanog הומ…

Discussion

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19. למרות דיווחים רבים פורסמו בהקשר זה, מתודולוגיה מפורטת עבור אינדוקציה נוירוגנזה באמצעות קו P19 line נשאר ברור. יתר על כן, אנו מנוצלים גלוקוז גבוה פשוט (4,500 mg/L) DMEM בינוני עם 10% FBS עבור הניסוי כולו. הדבר איפשר לנו לבצע את הניסוי הנוירוגנ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר היה נתמך כספית על ידי מרכז המדע הלאומי, פולין (מענק לא. מו-2017/25/N/NZ3/01886) ויודע (מרכז המחקר הלאומי המוביל) קונסורציום מדעי “בעלי חיים בריאים-מזון בטוח”, החלטה של משרד המדע והשכלה גבוהה מס ‘ 05-1/KNOW2/2015

Materials

6x DNA Loading Dye EURx E0260-01
Agarose Sigma- Aldrich A9539
cDNA synthesis kit EURx E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) Sigma- Aldrich 10236276001 Working concentration: 1 μg/mL
DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine Lonza BE12-604Q
Ethanol 99.8% Chempur CHEM*613964202
Fetal Bovine Serum (FBS) EURx E5050-03
MAP2 antibody Thermo Fisher Scientific PA517646 Dilution 1:100
PCR reaction kit EURx E0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza DE17-602E
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ Lonza BE17- 517Q
Retinoic acid Sigma- Aldrich R2625-50MG  dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months
Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) Thermo Fisher Scientific A11034 Dilution 1:500
Skim milk Sigma- Aldrich 1153630500
TBE Buffer Thermo Fisher Scientific B52
Triton-X 100 Sigma- Aldrich T8787-100ML
Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without  Ca2+, Mg2+,with Phenol Red biosera LM-T1720/500
Cell Culture Plastics
1 mL Serological Pipettes Profilab 515.01
10 mL Serological Pipettes Profilab 515.10
100 mm dish dedicated for suspension culture Corning C351029
15 mL centrifuge tubes Sigma- Aldrich CLS430791-500EA
5 mL Serological Pipettes Profilab 515.05
6-well plate Corning CLS3516
Cell culture flasks, surface area 25 cm2 Sigma- Aldrich CLS430639-200EA

Referencias

  1. Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488 (2011).
  2. Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
  3. Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
  4. Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Biología del desarrollo. 371 (2), 170-179 (2012).
  5. ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
  6. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
  7. Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
  8. Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
  9. Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  10. McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Biología del desarrollo. 89 (2), 503-508 (1982).
  11. Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
  12. Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
  13. Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
  14. Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
  15. Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
  16. Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).
  17. Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
  18. Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
  19. Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
  20. Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  21. Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
  22. Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
  23. Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).
  24. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
  25. MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neurociencias. 80 (2), 487-499 (1997).
  26. Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
  27. Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
  28. Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
  29. Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neurociencias. 58 (4), 753-763 (1994).
  30. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).

Play Video

Citar este artículo
Leszczyński, P., Śmiech, M., Teeli, A. S., Zołocińska, A., Słysz, A., Pojda, Z., Pierzchała, M., Taniguchi, H. Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (146), e58225, doi:10.3791/58225 (2019).

View Video