P19胚癌細胞を用いて神経新生
1Department of Experimental Embryology, Institute of Genetics and Animal Breeding,Polish Academy of Sciences, 2Department of Regenerative Medicine,Maria Skłodowska-Curie Institute – Oncology Center, 3Department of Genomics and Biodiversities, Institute of Genetics and Animal Breeding,Polish Academy of Sciences
Summary
P19マウス胚癌細胞株(P19細胞株)は、生体内分析に比べて大幅に簡素化された神経新生の分子機構の研究に広く用いられている。ここでは、P19細胞株におけるレチノイン酸誘発神経新生に関するプロトコルを提示する。
Abstract
マウス胚由来の奇形癌に由来するP19細胞株は、3つの生殖層に分化する能力を有する。レチノイン酸(RA)の存在下で、懸濁培養P19細胞株はニューロンに分化するように誘導される。この現象は、インビトロで神経新生モデルとして広範囲に研究されている。したがって、P19細胞株は、神経新生に関連する分子および細胞研究に非常に有用である。しかしながら、文献に記載されているP19細胞株の神経分化のためのプロトコルは非常に複雑である。本研究で開発した方法は簡潔で、神経発達異常や神経変性疾患の分子機構解明に一役を果たします。
Introduction
胚の発達の間に、単一の細胞層は3つの別々の生殖層1、2、3に変換される。生体内で発生する現象の研究可能性を高めるために、便利なモデルとして三次元集合体(胚体)の生成が開発されました。このようにして形成された細胞凝集体は、細胞分化を引き起こす様々な条件にさらされ、胚4、5の発達を反映する。P19マウス胚癌細胞株(P19細胞株)は、ビトロ6、7、8における神経新生研究の細胞モデルとして一般的に使用される。P19細胞株は、典型的な多能性幹細胞の特徴を示し、細胞凝集中のレチノイン酸(RA)の存在下でニューロンに分化し、付着条件下で神経突起の成長を続けることができます。また、未分化P19細胞株は、ジメチルスルホキシド(DMSO)9、10、11、12の影響下で筋肉および心筋細胞様細胞を形成することもできる。
多くの方法13、14、15、16は、神経分化のために報告されているが、方法論は時々複雑であり、説明を読むだけでは理解しにくい。例えば、プロトコルは、ふくらはぎ血清(CS)と胎児ウシ血清(FBS)13の混合物を補充したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)培地の組み合わせを必要とする場合がある。さらに、神経発達に使用される培地は、しばしばニューロベースサルとB27サプリメント13、14、15、16で構成されている。そのため、既存のメソッドは準備の複雑さが含まれており、ここでの目標はプロトコルを簡素化することです。本研究では、FbSを用いてDMEMをP19細胞株(DMEM+10%FBS)の維持、ニューロン発達(DMEM+5%FBS+RA)に利用できることを実証した。P19細胞株を用いて神経新生を簡素化したこの簡略化された方法は、ニューロンがどのように発達するかの分子機構を研究することを可能にする。また、アルツハイマー病等の神経変性疾患に関する研究もP19細胞株17,18を用いて行われ、本研究で開発した方法が解明に一役を果たそして、神経発達異常および神経変性疾患における分子機構。
Protocol
1. 文化維持 メンテナンス培地中のP19細胞株を培養する(10S、100単位/mLペニシリンおよび100単位/mLストレプトマイシンを補充した4,500mg/Lのグルコースを含むダルベッコの改変イーグル培地)。37 °C および 5% CO2でインキュベートします。 2. サブ培養細胞 細胞が約80%の合流点に達すると、使用した培地を細胞培養フラスコから除去する(表面積25cm2)…
Representative Results
P19細胞株における神経新生誘導のためのプロトコルの簡略化されたスキームを図1に示す。未分化状態および神経新生中にP19細胞株の特性を定義するために、RT-PCR(逆転転写-ポリメラーゼ連鎖反応)法が用いた。未分化されたP19細胞株は、有機カチオン/カルニチントランスポーター4(Oct4)およびナノホメオボックス(ナノグ)などの多能?…
Discussion
ここでは、P19細胞株を用いて神経新生に対する簡単なプロトコルについて説明する。この点に関して多くの報告が発表されているが、P19細胞株を用した神経新生誘導の詳細な方法論は不明のままである。また、実験全体で10%FBSの簡易高グルコース(4,500mg/L)DMEM培地を利用しました。これにより、ユーザーフレンドリーな方法で神経原性実験を行い、将来的にこの方法の使用を拡大することがで?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ポーランド国立科学センター(助成金なし)によって財政的に支援されました。UMO-2017/25/N/NZ3/01886)とKNOW(リーディング国立研究センター)科学コンソーシアム「健康な動物-安全な食べ物」、科学・高等教育省の決定 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
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Citar este artículo
Leszczyński, P., Śmiech, M., Teeli, A. S., Zołocińska, A., Słysz, A., Pojda, Z., Pierzchała, M., Taniguchi, H. Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells. J. Vis. Exp. (146), e58225, doi:10.3791/58225 (2019).