Summary

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Published: May 03, 2018
doi:

Summary

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

Abstract

 종속 키 1 (Cdk1)는 모든 진핵생물의 세포 주기 위한 마스터 컨트롤러와 프로테옴;의 약된 8-13% phosphorylates 그러나, Cdk1, 특히 인간의 세포에에서 대 한 확인된 대상 수 여전히 낮습니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 중요 하다, 그들은 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법에 대 한 기계적 통찰력을 제공. 세포 주기 규칙 충실 한 염색체 분리에 대 한 중요 하 고이 복잡 한 과정에 결함 염색체 착오 및 암으로 이어질.

여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치를 식별 하는 데 사용 되는 설명 합니다. 이 분석 결과, 순화 된 단백질은 phosphorylated 생체 외에서 상용 인간 Cdk1/ B. 성공에 의해 인 산화 SDS 페이지에서 확인 및 인 산화 사이트 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. 우리는 또한 정화 프로토콜 간의 상호 작용을 조사 확인 된 인 산화 위치의 기능 검증에 대 한 키 니 아 제 분석 실험 및 바인딩 분석 결과 대 한 적합 한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 항복을 설명합니다 클래식 핵 지 방화 신호 (cNLS) 그리고 그것의 핵 수송 수용 체 karyopherin α. 실험 설계와 투입, 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 접근 방법을 검토 합니다. 함께 이러한 프로토콜 Cdk1 전용 인 산화 사이트를 생성 하 고 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구는 매우 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 때문에이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 그것은 적용할 수 있습니다 어떤 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에, 세포 기능 연구와 결합 하는 경우에 특히.

Introduction

Kinases는 기판에 ATP에서 인산 염 그룹을 전송 하 고 많은 세포질 과정을 조절 하는 효소. 이 인 산화 되돌릴 수, 빠르고, 두 부정적인 요금을 추가 및 저장 자유 에너지, 하 고 셀에서 사용 하는 가장 일반적인 posttranslational 수정 중 하나입니다. Cdk1, 일컬어 세포 주기 단백질 2 체 (cdc2)는 모든 진핵생물1,2,3,,45, 세포 주기 위해 마스터 컨트롤러가 고 phosphorylates는 프로테옴6,7의 예상된 8-13%.

최근 proteomic 연구는 단백질, 대부분의 경우에서에 많은 인 산화 사이트를 확인 하는 동안 키 이러한 수정에 대 한 책임을 알 수 있다. 인간 세포에서 특히 알려진된 Cdk1 목표의 수는 낮은7. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 설정 하는 기계 론 적인 연구를 하면 그것은 중요 하다. 세포 주기 규칙은 충실 한 염색체 분리 및 세포 분열에 대 한 중요 한 그리고 세포질 과정의 무수 한이 중요 한 생리 기능을 지원 하기 위해 발생 해야 합니다. 전사와 유사 분열, 세포의 구조와 핵, 염색체 응축, mitotic 스핀 들 어셈블리의 분해 등의 조직에 극적인 개편의 발병 이전 번역 중단 포함 됩니다. 규제 완화와 이러한 프로세스에서 오류가 발생할 암, 출생 결함, 또는 mitotic 세포 죽음. RO-3306 같은 Cdk1의 특정 억제제 개발된8, 기능성 연구를 위한 강력한 도구를 제공 하는 되었고 이러한 억제제 중 일부는 현재 암 치료에 대 한 임상 시험 (검토를 위해9 참조).

여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별 수 있도록 설명 합니다. 이 분석 결과에서 상용 인간 Cdk1/ B는 순화 대상 단백질에서 생체 외에서phosphorylate 데 사용 됩니다. 기판의 인 산화의 질량을 증가 하 고 추가 두 음 전; 따라서, 성공적인 인 산화는 SDS 페이지에 단백질 젤 밴드의 상승 교대에 의해 확인 된다. 인 산화 Cdk1 특정 사이트 이후 체 외에 phosphorylated 단백질의 질량 분석 분석에 의해 식별 됩니다. 실험적인 디자인으로 돕기 위해 우리는 또한 계산 도구와 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 참조를 검토 합니다. 또한, 우리는 또한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 니 분석 결과 대 한 적합 한 생성 하는 정화 프로토콜 설명 합니다. 마지막으로, 기능 연구에 의해 확인 된 인 산화 사이트를 확인 해야 합니다 그리고 여기에 설명 된 간단한 바인딩 분석 결과 그 목적을 위해. 결합, 이것은 매우 강력한 접근 Cdk1 세포 주기7,,1011를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구를 가능 하 게 Cdk1 관련 인 산화 사이트를 생성. 이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 이후 모든 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에 적용할 수 있습니다. 그러나, 취득된 인 산화 사이트에는 생체 외에서 의 기능 확인은 권장, 셀 추가 규제 메커니즘 posttranslational 수정, 상호 파트너 또는 셀룰러 지역화 같은 장소에는 인 산화 사이트 액세스할 수 또는 Cdk1에 의해 인식에 대 한 액세스할 수 없게 렌더링 수 있습니다.

Cdk1 어디 X 어떤 잔류물 이며 떠들고 또는 트레오닌 인 산화의 사이트 (Ser/Thr-프로-X-리스/Arg), 구성 된 합의 인 산화 사이트를 인식 합니다. 특히 중요 한 인식에 대 한 + 1 위치에 프롤린의 존재가입니다. + 2 또는 3 위치에 기본적인 잔류물을 선호 하는 또한, 대부분 Cdk1 관련 인 산화 사이트는 + 3에서 리스 또는 Arg를 포함 위치6,12.

Cdk1의 활성화 긴밀 하 게 규제 하 고 유사 분열1,2,3,,45의 발병에 연결 됩니다.  종속 kinases의 활동 일반적으로 진동 세포 주기13전역 수준에서 표현 되는 뚜렷한 cyclins ( A, B, C, D, 그리고 E 인간에서), 그들의 연관에 따라 달라 집니다. Cdk1는 일정 한 세포 주기 고  A와 B5,13,,1415로  규제 소 단위와의 연결에 의존 하는 그것의 활동의 규제 뿐만 아니라 포스트 번역 상 수정. Cdk1/ B 복합체의 형성이 키 니 아 제 활성화5,14,15,,1617,18에 대 한 필요 합니다. G2 단계  B는 cytosol에서 번역 및 그것은 Cdk15,14,15,16,,1718; 바인딩 핵을 가져올 그러나, Cdk1/ B 인간 Cdk1 억제 kinases Myt1에 의해 Thr14와 Tyr15 잔류물에 인 산화 (멤브레인 관련 티로신, 트레오닌-특정 cdc2 억제 키)와 Wee1, 각각19, 사 개최 20,21. 늦은 G2 단계에서 세포 분열 주기 25 인산 가수분해 효소 (cdc25)에 의해 Thr14와 Tyr15의 dephosphorylation Cdk1/ B 복합의 키 니 아 제 활동을 활성화 하 고 유사 분열12,14, 의 개시를 유발 18 , 20 , 22 , 23. Thr161 인 산화는 Cdk1/ B 활성화에도 필요 하 고 Cdk7, Cdk 활성화 키 (케이크)18에 의해 중재입니다.  B anaphase에의 생긴다 Cdk1을, 유사 분열24,25에서 출구를 허용. Cdk1/ B의 활성화는 따라서 복잡 한 과정입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 상용 Cdk1/ b 수행 곤충 세포에서이 복합물의 재조합 식 동안 활성화 된 vivo에서 생 kinases14,20 이며 순화 된 상태에서 활성 상태로 유지 합니다. 결과 활성화, 재조합 인간 Cdk1/ B는 생체 외에서 키 니 아 제 분석 실험에 적합 합니다.

여기, 우리는 인간의 centromere 단백질 F (CENP F)10Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별에 대 한 프로토콜을 설명합니다. CENP-F는 대부분 interphase (g 1과 S 상)의 중 핵에 있는 g 2 단계26,27,28 , Cdk1 종속 방식으로10에 cytosol에 수출 하는 kinetochore 단백질 11. 핵 지역화26이 분 cNLS 의해 수 여. cNLSs 핵 전송 요소 karyopherin α karyopherin β 및 RanGDP, 핵29에 cNLS 화물의 수입 촉진에 의해 인식 됩니다. G2 단계에서 핵 수출10알 수 없는 수출 통로 통해 촉진 된다. CENP-F는 cytosol에 있는, 일단 핵을 모집 하 고 차례 차례로 모터 단백질 복잡 한 다30,31신병. 이 통로 mitotic 항목의 정확한 타이밍에 대 한 및 두뇌에 있는 근본적인 과정에 대 한 중요 한 다 종속 방식 mitotic 스핀 들 어셈블리의 초기 단계는 centrosome 각각 핵 위치 하는 것이 중요 하다 개발30,,3132. G 2 단계에서 시작 해 서, CENP-F 또한 조립 되는 kinetochore에 충실 한 염색체 분리27,28,,3334,35에 대 한 중요 한 역할을가지고 . 이 통로의 주요 규제 단계는 Cdk110,11에 따라 g 2 단계에서 CENP-F의 핵 수출 이다. 여기 CENP F. cNLS에 Cdk1-관련 인 산화 위치의 식별 프로토콜 설명 이 사이트의 Phosphomimetic 돌연변이 CENP-f, B Cdk1/ 직접 CENP-F의 그것의 cNLS10의 인 산화에 의해 세포 지역화 조절 제안 핵 가져오기 천천히.

전반적으로,이 생체 외에서 니 분석 결과 수 있습니다 특정 기판의 식별을 키 Cdk1 정화 대상 단백질 phosphorylated 생체 외에서 상용 Cdk1/ B 복합물 및 인 산화 사이트에 대 한 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 계시 하는 기계 론 적인 연구를 지원 합니다.

Protocol

1. 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측 키 니 아 제 분석 실험을 시작 하기 전에 예측된 Cdk1 전용 인 산화 사이트에 대 한 단백질 시퀀스를 분석 하 고 알 수 없는 키도 실험적으로 설립된 인 산화 사이트에 대 한 문학을 검색 합니다. 사용 하 여 다음 도구, 데이터베이스, 및 요약 참조. IGPS 3.0 소프트웨어,3637 (http://gps.biocuckoo.org/o…

Representative Results

최근 포함 cNLS10CENP-F 조각에서 Cdk1 관련 인 산화 사이트를 식별 하는 생체 외에서 니 분석 결과 (그림 1) 사용 했습니다. 이 신호는 대부분의 interphase 동안 CENP F의 핵 지역화를 수 여. G2 단계에서 CENP F Cdk1 종속 방식에서 cytosol에 핵에서 수출 된다. Cdk1 CENP-F의 셀룰러 지역화를 조절 하는 방법에 대 한 기계적 통찰력을 얻으려면, ?…

Discussion

우리의 생체 외에서 니 분석 결과 세포 주기의 마스터 컨트롤러 및 많은 중요 한 세포질 과정을 조절 키 Cdk1를 위한 분자 표적을 식별 하는 매우 강력한 방법입니다. 메서드는 순화 된 단백질 Cdk1에 대 한 기판 이며 수 인 산화 특정 사이트의 경우 결정 합니다. 이 Cdk1 통해 인 산화에 의해 세포 프로세스의 규칙을 위한 기계 연구를 촉진 한다.

질량 분석에 의해 인 산화 위…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 질량 분석 분석 및 유용한 의견에 대 한 박사 데이비드 킹, 하 워드 휴즈 의학 연구소, 캘리포니아 대학 버클리를 감사합니다. 우리는 박사 Xuelian 주, 상하이, 생물 과학을 위한 학회, 과학의 중국 아카데미, 상하이, 중국 전체 길이 CENP F 구조를 제공 하기 위한 감사 합니다. 마지막으로, 우리는 감사 박사 수잔 베인 박사 브라이언 칼라, 빙 엄 턴 대학에서 박사 Christof Grewer 장비에 대 한 액세스. 이 연구는 뉴욕의 주립 대학 및 대학의 뉴욕 주립 빙햄 턴 화학과 연구 재단에 의해 투자 되었다.

Materials

2800 ml baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 ml) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 ml) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778

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Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).

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