Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Kinasen sind Enzyme, die Übertragung von Phosphatgruppen von ATP auf Substraten und regulieren viele zelluläre Prozesse. Diese Phosphorylierung ist reversibel, schnell, fügt zwei negative Ladungen und freie Energie speichert und gehört zu den häufigsten posttranslationale Modifikationen von Zellen verwendet. Cdk1, die auch bekannt als Zellteilung Zyklus Protein 2 Homolog (cdc2) ist ein master-Controller für den Zellzyklus in allen Eukaryoten^1,2,3,4,5, und phosphorylates ein Geschätzte 8 bis 13 % des Proteoms^6,7.

Während Proteomik-Studien haben viele Phosphorylierung Websites in den Proteinen, in den meisten Fällen identifiziert ist die Kinase verantwortlich für diese Änderungen unbekannt. Die Anzahl der bekannten Cdk1 Zielen, vor allem in menschlichen Zellen ist niedrig⁷. Die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ist wichtig, da es mechanistische Studien, die festlegen ermöglicht, wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Regulierung des Zellzyklus ist wichtig für Treue Chromosom Segregation und Zellteilung, und eine Vielzahl von zellulären Prozessen auftreten, um diese wichtige physiologische Funktion unterstützen müssen. Dazu gehören aufzuhalten, Transkription und Translation vor dem Beginn der Mitose sowie eine dramatische Reorganisation in zellulare Struktur und Organisation, z. B. Demontage der Kernhülle, Chromosom Kondensation und Montage der mitotischen Spindel. Deregulierung und Fehler in diesen Prozessen verursachen Krebs, Geburtsschäden oder mitotische Zelltod. Spezifische Inhibitoren des Cdk1 wie RO-3306 waren entwickelten⁸, die bieten leistungsstarke Tools für funktionelle Studien, und einige dieser Inhibitoren sind derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von Krebs (siehe⁹ zur Überprüfung).

Hier beschreiben wir einen in-vitro- Kinase Assay, der die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ermöglicht. In diesem Test wird kommerziell verfügbare menschliche Cdk1/cyclin B verwendet, um eine gereinigte Ziel Protein in Vitrophosphorylieren. Phosphorylierung eines Substrates erhöht seine Masse und fügt zwei negative Ladungen; daher bestätigt erfolgreiche Phosphorylierung eine aufwärts Verschiebung der Protein Gel Band auf SDS-PAGE. Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites werden anschließend durch Massenspektrometrie Analyse des Proteins in Vitro phosphoryliert identifiziert. Experimentelles Design unterstützen, überprüfen wir auch Berechnungswerkzeuge und Referenzen für die Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites die Proteinsequenz. Darüber hinaus erläutern wir im folgenden Reinigung-Protokolle, die sehr reine und homogene Protein Vorbereitungen für die Kinase Assay ergeben. Schließlich identifizierte Phosphorylierung Websites durch funktionelle Studien überprüft werden müssen, und eine einfache Bindung-Assay wird hier beschrieben, für diesen Zweck. Kombiniert, ist dies ein sehr leistungsfähiges Ansatz, der Renditen Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und mechanistische Studien in wie Cdk1 den Zellzyklus^{7,10,11 steuert}. Da diese Methode auf gereinigten Proteinen angewiesen ist, kann es zu jedem Modell Organismus und Erträge zuverlässige Ergebnisse angewendet werden. Funktionale Überprüfung des erhaltenen Phosphorylierung Websites in Vitro wird jedoch empfohlen, wie Zellen zusätzliche regulatorische Mechanismen, z. B. posttranslationale Modifikationen, Interaktionspartner oder zellulären Lokalisation verfügen, kann Phosphorylierung Websites oder unzugänglich für die Anerkennung von Cdk1 rendern.

Cdk1 erkennt eine Konsens-Phosphorylierung-Website, die besteht aus (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), wo X ist keine Rückstände und ein Serin oder Threonin der Ort der Phosphorylierung ist. Besonders wichtig für die Anerkennung ist das Vorhandensein von Prolin in der + 1-Position. Darüber hinaus werden grundlegende Rückstände in den + 2 oder + 3 Positionen bevorzugt, mit die meisten Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites mit einer Lys oder Arg auf die + 3 position^6,12.

Aktivierung des Cdk1 ist streng geregelt und führt zu Beginn der Mitose^1,2,3,4,5. Im Allgemeinen hängt die Aktivität von cyclin-abhängigen Kinasen ihre Assoziation mit deutlichen Cyclin (cyclin A, B, C, D und E in den Menschen), die bei oszillierenden Ebenen in der gesamten Zellzyklus¹³ausgedrückt werden. Cdk1 Ausdruck ist konstant über den Zellzyklus und die Regulierung ihrer Tätigkeit stützt sich auf seine Assoziation mit den regulatorischen Untereinheiten cyclin A und cyclin B^5,13,14,15, als gut als Post-translationalen Modifikationen. Bildung des Cdk1/cyclin B-Komplex ist erforderlich für die Kinase Aktivierung^{5,14,15,16,17,18}. In der G2-Phase cyclin B übersetzt in das Zytosol und importiert in den Zellkern, wo es an Cdk1^{5,14,15,16,17,18 bindet}; jedoch wird Cdk1/cyclin B inaktiviert durch Phosphorylierung an Thr14 und Tyr15 Rückstände von der menschlichen Cdk1-hemmenden Kinasen Myt1 (cdc2-hemmenden membranassoziierten Tyrosin und Threonin-spezifische Kinase) und Wee1, bzw.^{19gehalten, 20,21}. In der Spätphase der G2 Dephosphorylation Thr14 und Tyr15 durch Zellteilung Zyklus 25 Phosphatase (cdc25) aktiviert die Kinase-Aktivität des Cdk1/cyclin B-Komplex und löst die Einleitung der Mitose^{12,14, 18 , 20 , 22 , 23}. Phosphorylierung des Thr161 auch für Cdk1/cyclin B Aktivierung ist erforderlich und wird durch Cdk7, die Aktivierung von Cdk-Kinase (CAK)¹⁸vermittelt. Abbau von cyclin B in Anaphase inaktiviert Cdk1, so dass Ausstieg aus Mitose^24,25. Aktivierung des Cdk1/cyclin B wird daher ein komplizierter Prozess. Die hier vorgestellten Protokoll erfolgt mit handelsüblichen Cdk1/cyclin B. Während rekombinante Expression dieses Komplexes in Insektenzellen es aktiviert in Vivo durch endogene Kinasen^14,20 ist und bleibt aktiv im gereinigten Zustand. Die daraus resultierende aktive, rekombinante menschliche Cdk1/cyclin B eignet sich für in-vitro- Kinase-Assays.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites in den menschlichen Zentromer Protein F (CENP-F)¹⁰. CENP-F ist ein Kinetochor-Protein, das befindet sich im Zellkern während der meisten Zeit der Interphase (G1 und S-Phase) und der Ausfuhr nach dem Zytosol in der G2 Phase^26,27,28 in einer Cdk1-abhängigen Weise^{10, 11}. nuklearen Lokalisierung durch einen zweiseitigen cNLS²⁶gewährt wird. cNLSs werden von den Nukleartransporten Faktor Karyopherin α, erkannt, die zusammen mit Karyopherin β und RanGDP, die Einfuhr von cNLS-Cargo in den Zellkern²⁹erleichtert. Nuclear Export in der G2-Phase wird über eine unbekannte Export Weg¹⁰erleichtert. Sobald CENP-F in die Zellflüssigkeit befindet, es wird eingestellt, um die Kernhülle und wiederum stellt den motor Protein Komplex dynien^30,31. Dieser Weg ist wichtig, den Kern der Centrosome entsprechend während der Anfangsphase der mitotischen Spindel Baugruppe in ein dynien-abhängigen Weise positionieren ist wichtig für das richtige Timing der mitotischen Eintrag und ein grundlegender Vorgang im Gehirn Entwicklung^30,31,32. Beginnend in der G2-Phase, wird CENP-F auch in das Kinetochor eingebaut wo hat wichtige Aufgaben für Treue Chromosom Abtrennung^{27,28,33,34,35} . Ein wichtigster regulatorische Schritt dieser Wege ist der nuklearen Export von CENP-F in der G2-Phase, die Cdk1^10,11abhängig ist. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites in die cNLS CENP-f Phosphomimetic Mutationen dieser Seiten verlangsamen nuclear Import von CENP-F, was darauf hindeutet, dass Cdk1/cyclin B direkt zellulären Lokalisation der CENP-F durch Phosphorylierung von seinem cNLS¹⁰regelt.

Insgesamt, dieser in-vitro- Kinase Assay ermöglicht die Identifikation von spezifischen Substraten für die Kinase Cdk1. Purified Zielproteine phosphorylierten in Vitro durch die im Handel erhältlichen Cdk1/cyclin B-Komplex und die Phosphorylierung Websites sind werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Die Identifikation des Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites unterstützt mechanistische Studien, die zeigen, wie Cdk1 Zellzyklus steuert.