Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.
Microglia 뇌 식 세포 두뇌 항상성에 참여 하 고 지속적으로 장애, 부상 및 질병에 대 한 그들의 환경 조사는. 첫 번째 응답자로 microglia 신경 및 명과 장애를 완화 하기 위해 중요 한 기능 그리고이 과정에서 그들은 다양 한 형태 론 적 변화를 받게. Microglia 형태학 기술적 분류 될 수 있다 또는, 또는, 셀 분파, 복잡성, 모양 등의 매개 변수에 대 한 지속적인 가변으로 측정할 수 있습니다. Microglia 측정 방법 단일 셀에 적용 하는 동안 몇 가지 기술을 여러 microglia 전체 photomicrograph에 적용 됩니다. 이 방법의 목적은 여러 계량 하 고 쉽게 사용할 수 ImageJ 프로토콜을 사용 하 여 단일 셀. 이 프로토콜은 단계 요약 ImageJ 플러그인 대표 이진 및 해당 이미지에 형광 고 밝은 필드 photomicrographs를 변환 하 고 그들을 분석 하는 것이 좋습니다 (2D/3D) AnalyzeSkeleton 및 FracLac 소프트웨어 플러그인을 사용 하 고 형태 데이터 컬렉션에 대 한입니다. 이러한 플러그인의 출력 프로세스 끝점, 교차점, 및 길이 뿐 아니라 복잡성, 셀 모양 및 크기 설명자 셀 형태를 요약합니다. 여기에 설명 된 뼈대 분석 프로토콜은 FracLac 무료 개별 셀 분석을 제공 하는 반면 전체 photomicrograph 또는 관심 (ROI)의 지역 내에서 여러 microglia 지역 분석에 대 한 적합 합니다. 결합, 프로토콜은 목표, 건강 하 고 손상 된 두뇌에 다양 한 microglia 형태학 사이 충에 사용 될 수 있는 민감한, 그리고 종합 평가 도구를 제공 합니다.
Microglia 있는에 대 한 즉각적이 고 다양 한 형태 론 적 응답 변경 가능성의 연속체를 따라 뇌 생리학1 드 없는 및 amoeboid 형태학2에 하이퍼 분파와 매우 복잡 한 형태학에서 다양 . Microglia 또한 편광 및 막대 모양의3될 수 있습니다. Microglia 셀 분파 일반적으로 여러 프로세스 하는 데 복잡 한 모양으로 정의 된 고 셀 당 끝점의 수와 세포 프로세스의 길이 자주 보고 됩니다. Microglia 연속 셀 잡담 그리고 vivo에서 운동 성4,5신경 그리고 glial 기능을 정밀 하 게 조정 된다, 때문 microglia 형태학에 다양 한 세포 기능 및 장애의 지표로 사용할 수 있습니다. 두뇌. 양적 접근 필요 적절 하 게 이러한 morphologic 변화의 다양성을 설명 하 고 없는 셀 (예: 간 질5,6 미묘한 생리 물결에서 발생 하는 간의 차이 구별 하는 그리고 뇌 진 탕7) (스트로크8) 같은 심한 부상에 뿐만 아니라. 형태학 정량화7,8,9,10,11,12,,1314 의 사용 증가 건강 및 질병 동안 microglia 형태학의 전체 다양성을 발표할 예정 이다. 현재 연구 ImageJ 플러그인 microglia의 형광 또는 비 형광 photomicrographs에서 microglia 형태를 요약 하는 데 필요한의 단계적 사용 immunohistochemistry (IHC) 후 고정된 쥐 나 조직에 취득 세부 사항.
중앙 분석 기술을 설명 하는 ImageJ 플러그인 AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, 2010 년 큰 유 방 구조, 계량에 개발 및 FracLac16, ImageJ 및 프랙탈 분석을 통합 하는 2014 년 개발 계량 개별 microglia 모양. 이러한 플러그인 전체 photomicrographs 이내 microglia 분파의 신속한 분석 또는 photomicrograph에서 정의 된 투자 수익의 여러 microglia를 제공합니다. 이 분석은 혼자 또는 보완 프랙탈 분석에 사용할 수 있습니다. 단일 셀 프랙탈 분석 (FracLac) 시간의 투자가 필요 하지만 microglia 복잡성, 모양 및 크기에 관한 여러 형태로 출력을 제공 한다. 두 도구를 사용 하 여 중복, 셀으로 분파는 셀 복잡성, 상호 보완적 이며 여러 매개 변수 조합 데이터 집합12,17내 다양 한 microglia 형태학 사이 구별 하는 데 사용할 수 있습니다.
Microglia 셀 가늘게 생리학과 병리학 그들의 마이크로-도메인 내에서 조정 하 고 미묘한7,14 에 심한 부상8형태학2 의 다양 한 범위를 표시 합니다. ImageJ 프로토콜의 사용 microglia 형태학 정량화 모든 실험실에 액세스할 수 있는 플랫폼으로 만들고 플러그인 오픈 소스 이미지 프로세싱 소프트웨어는. 설명된 프로토콜 이미지 처리 및이 소프트웨어를 사용 하 여 분석에 초점을 맞추고, 하는 동안 데이터 수집, 유효성 및 안정성의 일관성 우수한 IHC와 현미경 검사로 시작 합니다. 이 프로토콜 이진, 해골, 그리고 전체 photomicrographs 및 단일 셀의 개요 대표를 개선 하는 데 사용 하지만 가난한 IHC 염색의 자리를 차지할 수 없습니다 그리고 낮은 반면, 결과 현미경 흐리게, 또는 왜곡 이미지. 추가 고려로 해야 합니다 주의 microglia 형태를 번복할 수 변경 저장, 단면, 전에 동안 뇌 조직의 병합을 하지. 마지막으로, 각 실험에서 microglia 해야 될 몇 군데 같은 현미경으로 동일한 규모를 사용 하 여. 계측, 목표, 및 소프트웨어 현미경 비슷한 목표에도 불구 하 고 다른 크기의 photomicrographs 귀착되 고 세부 사항 뿐만 아니라 각 프레임 내에서 셀의 수 사이 다. 예를 들어 이미지 수집 Leica SPII에 40 X 목표를 사용 하 여 두 수 세포와 수집 Zeiss 880을 사용 하 여 보다 자세히 결과. 이것은 전체 프레임 보다는 단일 셀에서 수집 된 셀 분파 데이터에 대 한 특히 중요 한이 데이터 샘플링의 문제가 된다.
일반적으로, 해골 분석 전체 photomicrograph를 이용 하는 두 가지 이유로 단일 셀 프랙탈 분석을 선행 한다. photomicrograph에 있는 모든 셀의 결정 셀 분파는 급속 한 때 단일 셀 프랙탈 분석에 비해 시간이 요인 경우 심사 도구로 고려 될 수 있습니다. 또한, 골격 분석 하는 동안 파생 된 이진 이미지 프랙탈 분석을 위해 사용 됩니다. 일단 몇 군데, 사용자 영향을 소개 기초 분석 결과 영향을 미칠 수 있는 중요 한 단계 수가 있습니다. 사용자 간의 대부분 변수 프로토콜 단계 단계 4.2 (증가 이미지 밝기) 이며 (임계값 결정) 4.5 단계. 가능 하면, 밝기 (0-255 사이의 max 또는 min 슬라이더)를 증가 하는 최적의 수 결정 이며 모든 이미지와 사용자를 위해 일정 하 게 유지. 이미지 변화는 훌륭한, 사용자 대신 밝기는 이미지 사이 선택할 수 있습니다. 또는, 이미지는 밝고 콘트라스트가 높은 경우 생략 될 수 있습니다 다음 밝기를 증가 하 고 임계 처리 전문 임계값 필터를 사용 하 여 표준화 될 수 있다 (예., 황) 보다는 더 많은 변수 기본. 일단 최적화, 추가 사용자 영향을 최소화 하기 위해 매개 변수를 준수 해야 됩니다.
사용자 가변성의 예는 그림 5에 표시 됩니다. 따라서 다양성 증가 사용자 1과 사용자 2 모두 데이터 컬렉션에 기여 하는 경우와 데이터 값 사용자 1과 사용자 2 대 증가 했다. 사용자 1 및 사용자 2 바이너리 및 해당 이미지의 차이의 예를 들어 컬러 서클 (그림 5)에 의해 강조 표시 됩니다. 이 경우, 두 사용자가 microglia에 제한 된 전문성을 갖춘 짧게 훈련된 학부 학생 이었다. 정기적인 감독과 microglia 증가 프로토콜 교육2 함께 전문가 의해 멘토링 간 사용자 가변성을 줄일 수 있습니다. 비록 여기 평가 하지, 프랙탈 분석이 작습니다 간 사용자 변화에 따라 이진은 수동으로 하 고 개별적으로 고립 된 임계 처리 microglia 모양 결정에 전적으로 의존 하는 것 보다는 한 photomicrograph 이기 때문에. 그러나, 모든 방법을 사용자 간의 몇 가지 변화를 보유합니다. 따라서, 단일 사용자 (이상적으로, 일부 전문 microglia 셀에 의해 훈련)는 전체 데이터 집합에 대 한 데이터 수집을 완료 해야 합니다.
추가 수정이이 프로토콜을 쉽게 만들 수 있습니다 하 고 이미지 품질과 노이즈를 줄이고 과정 연결을 보장 하는 노력에 따라 달라 집니다. 예를 들어 대비 충분 한 경우에, 언샵 마스크 필요 하지 않습니다 그리고 생략 될 수 있습니다. 그것은 최적화 하 고 이미지, 실험 사례 및 전체 집합에서 데이터를 수집 하는 전에 컨트롤의 특정 집합에 대 한 프로토콜을 마무리 하. 마지막으로, 추가 플러그인 사용할 수 있습니다 다른 장소를 명확히 하거나 이전에이 프로토콜에서 설명 되지 않은 이미지를 선명 하 게와 같은 팽창 또는 선명 하 게.
이 프로토콜의 이점은 그것의 보편적인 가용성 및 적응성 이다. 또한, 신속 하 고 전체 photomicrograph에 적용은 AnalyzeSkeleton를 사용 하 여 셀 분파를 평가입니다. 다중 셀 분석 방법의 이점은 전체 지역 보다는 단일 셀에 초점 이다. 따라서, 신속 하 게 이미지 내의 모든 microglia의 조건 (끝점 및 프로세스 길이) 평균 분파를 평가 가능 하다. 여러 셀의 분석을 제공 하는 뼈대 분석: 프랙탈 분석 photomicrographs에서 단일 셀을 필요한 시간 투자 때문에 의해 일치할 수 없는 셀 숫자의 측면에서 데이터 샘플링. 이 보일 수 있는 가장 적합 한 인스턴스 microglia 형태학 근거리 초점 부상에서 상영 될 것입니다. 한 제한은 전체 필드 이미지 렌더링 IHC photomicrographs의 뼈대 모델을 만들 때 더 많은 시간이 소요 단일 셀 방식에 비해 완벽 하지 않습니다. 또한, 지역 분석 적합 하지 않다 상황에 크게 동일한 필드 내 다른 microglia 형태학이 있다. 마지막으로,이 분석 방법은 세포 수, 실험 조건 간에 다를 수 매개 변수에 따라 달라 집니다.
프랙탈 분석 단일 셀에 진행 되며 따라서 뼈대 분석에서 결과 평균 셀 분파 데이터 출력을 보완 한다. 하지만 훨씬 더 많은 시간을 소모 하 고,이 투자 형태학 데이터의 광범위 한 범위를 생성 합니다. 예를 들어 세포 밀도, 스팬 비율, 그리고 순환 데이터 크기, 연신 율, 및 셀 개요의 모양을 각각 설명. 프랙탈 차원 및 lacunarity 요약 셀 복잡성과 모양이, 각각. 각 매개 변수를 계산 하는 방법 및 데이터 해석 될 수 있습니다 방법의 자세한 요약 대화형 수동16 에서 제공 되 고 같은 세부 구체적인 연구 질문에 관하여 고려 되어야 한다. 척도 생리 및 pathologic 조건에서 발생할 수 있는 2D microglia 형태학에 작은 변화를 중요 한 도구에 설명 된 프로토콜 결과. 견고, 볼록함이, 폼 팩터16,20 등 추가 형태학 분석 가능한 3D 도형을 생성 하는 경우 있을 수 있습니다.
프로토콜 개발 및 적응은 지속적이 고 사용자 중심. 그것은 소량/밝은-필드 이미지7 하지만 아직 임베디드 조직 파라핀 형광8 에서 확장 되었습니다. 그것은 또한, 추가 분석에 대 한 Imaris 등 독점 소프트웨어와 함께에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 생리학의 다양 한에 적용 될 수 microglia에 국한 되지 않습니다 하지만 어떤 셀 또는 특정 패턴 또는 IHC 메서드를 사용 하 여 식별 될 수 있는 조직에 적용 될 수 있습니다. 마지막으로, 충분 한 샘플 크기, 복수 또는 클러스터 분석에 적용할 수 있는 형태12,21;에 따르면 microglia 충 이것은 의미 있는 정보 microglia 형태학은 microglia 기능 및 그들의 주위에 응답의 중요 한 지표 이다입니다. Microglial 형태 론 적 다양성에 대 한 감사는 확장 하 고 완전히 건강 및 질병 명과 혈관 신경 상호 작용을 이해 하는 것이 중요. 이 분야에 있는 성장 계량 microglia 형태학 여러 연속 변수를 사용 하 여 요약을 개발, 사용 하기 쉬운, 그리고 재현성 프로토콜에 의해 향상 됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NINR (F32NR013611)에서 재정 지원을 받았다. 우리는 더 인정 하 고 AnalyzeSkeleton(2D/3D) 및 FracLac의 개발자 감사 합니다 하 고 싶습니다 (알 간다 카레라스 외. , Karperien 그 외 여러분, 각각)는 여기에 설명 된 분석 되지 않을 것 이라고 수 없이.
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |