לכימות מיקרוגלייה מורפולוגיה של Photomicrographs של אימונוהיסטוכימיה מוכן רקמות באמצעות ImageJ

כל הניסויים שאושרו על-ידי וביצע בהתאם להנחיות שנקבעו על-ידי אוניברסיטת אריזונה. טיפול בבעלי חיים מוסדיים ואת הוועדה להשתמש NIH הנחיות טיפול ושימוש חיות מעבדה. הוקדשה כדי למזער את חיה בכאב ואי נוחות. שיטות המתת חסד הם על פי פרוטוקול שאושר, מורכב עריפת ראש צוואר הרחם תחת הרדמה איזופלוריין. 1. רקמות הכנה הערה: לבצע ניתוח מורפולוגיה מיקרוגלייה על דגימות רקמה cryoprotected קבוע, כדי לשמר את התא מורפולוגיה. לפניכם פרוטוקול רגיל להכין ולקבל ישירות לחתוך רקמות קבוע עבור קרינה פלואורסצנטית IHC. הסר את המוח עכבר או חולדה חיה לאללה לאחר הניסוי הרצויה ועל פי פרוטוקול סטנדרטי מעבדה. למקם את המוח לתוך בקבוקון 10 מ”ל המכיל 5 מ של פתרון paraformaldehyde 4% עבור 24 שעות-4 מעלות צלזיוס. ואז לשטוף ואת המקום אל תוך 5-10 מ”ל פוספטים 30% סוכרוז buffered פתרון (PBS, 0.01 M) 72 h-4 מעלות צלזיוס. לאחסן כל המוח ב- 80 ° C עד רקמות חלוקתה עם cryostat או ב 4 ° C אם חלוקתה עם מיקרוטום.הערה: פרוטוקול זה לא כבר נבדקו באמצעות רקמות פרוסים מרקמות פרפין-מוטבע. סעיף רקמת המוח עובי המקטע הרצוי, התמצאות באמצעות סעיפים לתרשים או cryostat או מיקרוטום בעלת החנות בפתרון cryoprotection (50 מ”מ ל- PBS, אתילן גליקול, גליצרול) ב-20 ° C.הערה: פרוטוקול זה בהצלחה התבצע על מקטעי רקמת הילתית החל מיקרומטר 50 מיקרומטר 200 עובי. רקמות סעיפים פחות מאשר 50 מיקרומטר עשוי ללכוד את טווח מלא של תהליכים מיקרוגלייה, בסעיפים רקמות עבות, IHC מכתים עשוי להיות לא מושלם עקב נוגדנים חדירה לתוך רקמות. רקמות יכול להיות הכיוון משרטוטי גם ב הפרונטליים או הווריד, בחירה זו תהיה תלויה region(s) המטרה והמוח ניסיוני שילמדו. 2. אימונוהיסטוכימיה הערה: ניתן להחיל שלד ושיטות ניתוח פרקטל זריחה או 3, 3′-diaminobenzidine (DAB) IHC. להלן פרוטוקול IHC קרינה פלואורסצנטית רגילה, יכול להיות מוחלף בהתאם לצורך. קרינה פלואורסצנטית IHC התשואות סופריור ויזואליזציה של תהליכי התא בהשוואה IHC כי אמחה קלות. במקום הסעיפים רקמה לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ”ל (עד 15 העכבר מוח מקטעים/מבחנה), דגירה עם 1 מ”ל של פתרון המכיל עד כדי 10% הסוס סרום, PBS (0.01 M), 0.5% טריטון, נאן 0.04%3 בטמפרטורת החדר (23 ° C) לשעה. רחץ במשך חמש דקות עם PBS (0.01 M) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. דגירה עם נוגדן ראשוני (Iba1, 1:1, 000) בטמפרטורת החדר במשך 72 h ב- 1 מ”ל של פתרון המכיל PBS (0.01 M), 0.5% טריטון, נאן 0.04%3, ומקורה (כדי לשמר את האפקטיביות3 נאן). רחץ במשך חמש דקות עם PBS (0.01 M) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. דגירה עם הנוגדן המשני (אנטי-ארנב 488, 1:250) מכוסה בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות ב- 1 מ”ל של לאודנום PBS (0.01 M), 0.5% טריטון, נאן 0.04%3 רחץ במשך חמש דקות עם PBS (0.01 M) שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. הר הסעיפים רקמת המוח (מספר וכיוון בהתבסס על העדפות) על השקופיות לספסל, להחיל בינוני רך-ערכת הרכבה על השקופית, הצב את coverslip על הרקמה. לאחסן את השקופיות ב 4 º C.הערה: עובי זכוכית 1.5 coverslip נדרש עבור הדמיה קונפוקלי. רך-set הוא מדיום הרכבה מועדף בגלל צמיגות גבוהה לא לדחוס את הרקמה ושומרת הטוב המורפולוגיה בהשוואה הרכבה hard-set מדיה. 3. הדמיה תמונה Iba1 תאים חיוביים במקטע רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או קונאפוקלית זה יש יכולת רכישת z-מחסנית באמצעות 20 X אובייקטיבית אחת או יותר.הערה: הדמיה פרמטרים ולהגדרה תוכנה צריכה להיות קבועה עבור כל רכישה photomicrograph בניסוי. פירוט תהליך מעולה מתקבל באמצעות 40 X או המטרה X 63. זה אפשרי ליישם את הפרוטוקול ניתוח שלד המתוארים בזאת photomicrograph כולו או של רועי מרובת-תאים בתוך photomicrograph גדול. לרכוש תמונות 8 סיביות על-ידי שימוש בהגדרות התוכנה המתאימה ספציפי על התוכנה מיקרוסקופ.הערה: ההמרה של קבצים ל- 8 סיביות שלאחר הרכישה שעלולה לעוות את איסוף הנתונים. לרכוש לפחות 30 מיקרומטר z-מחסנית עם לא יותר מרווח 2 מיקרומטר בין תמונות באמצעות הגדרות תוכנה מתאימה ספציפית לתוכנה מיקרוסקופ.הערה: המיקרוסקופ והתוכנה צריך לאפשר ייבוא תמונות בציר X, Y ו- Z. Z-מחסנית ניתן להגדיל, מרווח הזמן עשוי להיות ירד כדי לספק פרטים נוספים מיקרוגלייה. בתמורה, הדמיה זמן יגדל. השתמש הדגימה של נייקוויסט במידת האפשר עבור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. לשמור את כל הקבצים כקבצי Tif או כנדרש על-ידי התוכנה מיקרוסקופ. לפתוח את קבצי Tif ב- ImageJ, להשתמש בסרגל הכלים כדי לפצל ערוצים על ידי לחיצה תמונה | צבע | פצל ערוצים, מחסנית תמונות על ידי לחיצה תמונה | ערימות | X פרוייקט | הטלה בעוצמה מקסימלית במידת הצורך. לשמור כקבצי. tif. 4. שלד ניתוח להוריד פיג’י או ImageJ מ . להורדה תוספים בודדים, AnalyzeSkeleton(2D/3D) מ- 15 ולהוריד FracLac מ 16.הערה: תהליך המרה של photomicrograph ל- skeletonized תמונה בינארית לוקח פחות מ- 1 דקות. אם משתמש photomicrograph על-ידי קרינה פלואורסצנטית, להבטיח שכשהתמונה היא של 8 סיביות ולהמיר לגווני בצורה הטובה ביותר להמחיש מכתים כל חיובי. השתמש בסרגל הכלים, לחץ על תמונה | טבלאות בדיקת מידע | אפורים. אם משתמש של DAB המוארים-שדה צילום, שימוש ראשון bandpass FFT לסנן תוסף (באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | FFT | מסנן bandpass) ולאחר מכן להמיר לגווני אפור.הערה: לצורך של פרוטוקול זה, ImageJ הגדרות ברירת המחדל מסנן Bandpass FFT הן מספיקות (מסנן עד 3 פיקסלים, ל-40, אין דיכוי פס). החלת מסנן FFT Bandpass הסרת רעש (תכונות קטנות) תוך שמירה על ההיבטים גדול הכולל של התמונה. פעולה זו יעילה במיוחד בתמונות שדה בהיר, שבו מתפצל סדקים ברקמת יכול להופיע בתור רקע, ובכך לסבך את הניתוח שלד18. להתאים את הבהירות והניגודיות אם התמונה מעומעם מדי, לא ניתן לאבחן את התהליך מיקרוגלייה. השתמש בסרגל הכלים, לחץ על תמונה | התאם | בהירות/חדות. התאם את המחוונים המינימלי או המקסימלי לפי הצורך, עד הקצוות של ההיסטוגרמה אבל לא יותר.הערה: ב- ImageJ, הבהירות והניגודיות מוחלפים על-ידי עדכון טבלת בדיקת מידע של התמונה (LUT), אז ערכי הפיקסלים אינן משתנות. מחווני Max ו- min לשלוט לגבולות העליון והתחתון של הטווח התצוגה, עם ערכי הפיקסלים מעל 255 המופיעים לבן וערכי פיקסלים מתחת ל-0 המופיעים שחור18. במקרה של זריחה photomicrographs, המחוון המירבי אמור לשמש, ואילו המחוון המינימלי ישמש עבור photomicrographs של DAB צבעונית מיקרוגלייה. הפעל במסנן ‘ הסר חידוד מסיכה ‘ להמשיך להגדיל את החדות בעזרת הכלים על ידי לחיצה תהליך | מסננים | הסר חידוד מסיכה. למטרות של פרוטוקול זה, הגדרות ברירת המחדל של ImageJ (רדיוס הפיקסל של 3 וליצירת מסיכה המשקל של 0.6) משמשים.הערה: חידוד מסיכה מחדד ומגבירה את התכונות קצוות של תמונה על-ידי הפחתה גרסה מטושטשת של התמונה (המסכה חידוד) מן המקור ולאחר מכן מיזוג התמונה שתיווצר עם גירסת ניגודיות גבוהה של התמונה המקורית. לכן, המסנן ‘ הסר חידוד מסיכה ‘ אינו יוצר פרטים, אך מעדיפה מבהיר את הפירוט הקיימים בתמונה. רדיוס שינויים בהגדרות איך מטושטשת על חידוד מסיכה יהיה (, ובכך לטשטש כמה יוסרו), ואת המשקל מסכת שינויים בהגדרות מידת הניגודיות זה הסר חידוד מסיכה ימוזגו עם (ומתאים ובכך את החדות של התמונה הסופית). לבצע צעד despeckle כדי להסיר מלח ופלפל רעש שנוצר על ידי חידוד מסיכה. השתמש בסרגל הכלים, לחץ על תהליך | רעש | הסרת לכלוכים.הערה: הפחתת כתמים הסרת רעש מלח ופלפל על-ידי החלפת כל פיקסל עם הערך החציוני בשכונה 3 × 3 שלה. התוצאה היא כי ליניאריים בעוצמתם מוחלפים הפיקסל החציוני מבלי להשפיע על החדות של קצוות18. המירו את התמונה למצב בינארית באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תמונה | התאם | סף.הערה: קביעת סף stratifies את התמונות בגווני אפור אל תכונות עניין לעומת הרקע, ממירה את התמונה הבינארית18. להחיל את despeckle, קרוב-, ולהסיר ליניאריים פונקציות: בתמונה בינארי וכתוצאה מכך, ייתכנו רעשי הרקע פיקסל יחיד ואת הפערים בין תהליכים. להחיל את הפונקציה despeckle באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | רעש | הסרת לכלוכים.הערה: החלת לנקות כתמים קבצים בינאריים התמונה מסיר כל רעש פיקסל יחיד הנותרים. להחיל את הפונקציה קרוב באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | בינארית | קרוב.הערה: תוסף זה מחבר שני פיקסלים כהים אם הם מופרדים על-ידי עד 2 פיקסלים. להחיל את הפונקציה ליניאריים הסרה באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תהליך | רעש | הסר ליניאריים.הערה: לצורך של פרוטוקול זה, בהיר ליניאריים מיועדים עם רדיוס הפיקסל של 2, סף של 50. תוסף זה מחליף פיקסל בהיר או כהה חריג חשוד טעות על ידי הפיקסלים החציוני באזור שמסביב אם זה בכשליש יותר מסוים ערך (הסף)18. לשמור את התמונה כקובץ נפרד עבור ניתוח שימוש ו/או פרקטל בעתיד, skeletonize את התמונה באמצעות הכלים על ידי לחיצה תהליך | בינארית | Skeletonize. בחר את התמונה skeletonized ולהפעיל את התוסף AnalyzeSkeleton(2D/3D) באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תוספים | שלד | לנתח את השלד, ובדיקת תיבת מידע אודות הסניף.הערה: סביר כי עיבוד התמונה ידרוש אופטימיזציה עם הוספה או מחיקה של הצעת שלעיל. בתהליך זה, תמונות skeletonized העריכו דיוק על-ידי יצירת כיסוי של השלד של התמונה המקורית. Somas צריך להיות מקור יחיד נקודות עם תהליכים שמקורם במרכז; somas מעגלית לבלבל את הנתונים, יש להימנע באמצעות פרוטוקול ההתאמה. דוגמה של נקודת מוצא יחיד לעומת somas מעגלית מודגם באיור1. בעיות נפוצות וכתוצאה מכך בלתי מייצג שלדים והציע פתרונות: התמונה עמום מדי: להמיר בגווני אפור, להתאים את המחוונים ‘ בהירות/ניגוד ‘, ו/או להחיל חידוד מסיכה יותר מדי רקע: להתאים את המחוונים ‘ בהירות/ניגוד ‘, החל Despeckle, ו/או להסיר ליניאריים Somas מעגלית בתמונת skeletonized (במיוחד עבור תמונות קרינה פלואורסצנטית): להחיל מסנן FFT Bandpass, ו/או חידוד מסיכה סדקים ברקמת (במיוחד עבור תמונות בהיר-שדה): החלת המסנן FFT Bandpass, ו/או הפחתת כתמים להעתיק את כל הנתונים מן התוצאות וכן מידע סניף פלטי להדביק את הנתונים בתוך גיליון אלקטרוני של Excel. ב- Excel, לקצץ את הנתונים כדי להסיר חלקי השלד הנובעות IHC ורכישת תמונות. שכפל את חוברת העבודה ניסוי עם פלט הנתונים הגולמיים מניתוח שלד ולהוסיף לקצץ שם הקובץ. כל הנתונים הבאים זמירה צריך להתרחש בחוברת המשוכפלת כדי לשמר את הנתונים הגולמיים לשימוש עתידי ללא הפניה. לקבוע איזה אורך של קטעים להיות מעוטרים מ ערכת הנתונים על-ידי פתיחת התמונה skeletonized ImageJ ובחירת הכלי קו. למדוד את מספר שברים, לוקח את הפתק של האורך הממוצע, ולהחליט על ערך סף.הערה: לצורך של הנתונים שהוצגו כאן, אורך חיתוך עבור חלקים לא רצויים הוא 0.5. ערך זה צריך להיות עקבי לאורך כל dataset. מותאם אישית למיין את הגיליון האלקטרוני Excel על-ידי לחיצה על מיון וסינון | מיון מותאם אישית. מיין לפי “קצה voxels” מהגדולה לקטנה, רמה חדשה, על ידי “Mx סניף pt” מהגדולה לקטנה. להסיר כל שורה המכילה 2 נקודות קצה באורך הענף מרבית של פחות ערך הסף (כלומר., 0.5). לסכם את הנתונים בעמודה נקודות קצה כדי לחשב את המספר הכולל של נקודות קצה שנאספו מתוך התמונה. חזור על ענף מידע נתונים: מיין לפי ‘סניף אורך’ מן הגדולה מהקטן לגדול. לגלול הנתונים ולהסיר כל שורה בעלת סניף אורך פחות ערך הסף(כלומר., 0.5). לסכם את הערכים בעמודה אורך סניף כדי לחשב את אורך כל הענפים שנאספו מתוך התמונה מסוכם. חזור על צעדים 4.11.3-4.11.5 עבור כל תמונה/גיליון עד כל הנתונים גזוז, לסכם. לחלק את הנתונים של כל תמונה (לסכם מספר נקודות הקצה של מסוכם סניף אורך) לפי מספר somas מיקרוגלייה בתמונה המתאימה. הזן את הנתונים הסופי (נקודות קצה/תא & סניף אורך/תא) לתוך תוכנה סטטיסטית.הערה: הנתונים אורך תא סניף מסוכם עשויה לדרוש המרה מאורך בפיקסלים מיקרון. 5. פרקטל ניתוח הערה: FracLac הוא מסוגל לרוץ מספר ניתוחים צורה שונה שאינם מכוסים פרוטוקול זה. הסבר מפורט יותר של FracLac של פונקציות שונות, עיין במדריך FracLac ב והפניות המשויכות 2,16,19. פרקטל אנליזה מנצל את השלבים פרוטוקול 4.1-4.7 שתוארו לעיל. לקבוע את גודלו של רועי זה ישמש עבור כל ניתוח פרקטל. השתמש בכלי מלבן כדי לצייר את רועי. ודא בתיבת גדול מספיק כדי ללכוד את כל התא יכול להישאר עקבי לאורך כל ערכת הנתונים.הערה: השתמש את מלבן הבחירה במקום הבחירה ביד חופשית כדי להבטיח כי כל ROIs למלבן בגודל זהה, ולכן התאים יש באותו הסולם. זה לא יהיה המקרה אם הבחירה ביד חופשית שימשו כי ImageJ יהיה התאם אוטומטית את גודל של רועי מרובע כדי להתאים את חלונות מלבני בגדלים שונים וכתוצאה מכך תאים עם סולמות שונים. בעוד צורות פרקטל בקנה מידה עצמאית, תהליך ניתוח fractal משתמש FracLac עבור ImageJ תלויה בקנה מידה16. לפיכך, יש הצורך רועי בגודל בעקביות לאורך כל אוסף נתונים. בחר באופן אקראי מיקרוגלייה לניתוח פרקטל כל photomicrograph וכל תמונה בינארי המתאימים. בחלון מנהל רועי, בחר עדכון כדי לנעול את רועי על מיקומו של התא. להשתמש Ctrl + Shift + D כדי לשכפל את שטחה של רועי כמו חלון חדש, ולאחר מכן לשמור את התא החתוכים. על התמונה בינאריים המתאימים (מניתוח שלד), לשכפל את האזור באותו התא באמצעות מנהל רועי. חזור עד מספר מספיק של תאים נבחרו באופן אקראי לצורך ניתוח פרקטל ולשמור את כל הקבצים.הערה: מחולל מספרים אקראיים ורשת ממוספרות יכול לשמש כדי לבחור באקראי תאים. פתחו את התמונה בינארי עם התא בודדים. לחצו פעמיים על הכלי מברשת צבע, לקבוע את הצבעים שחור, והתאם את רוחב המברשת כנדרש. באמצעות את photomicrograph תואמת כהפניה, להשתמש במכחול כדי להסיר תאים סמוכים תהליכים, חיבור תהליכים מפוצלים של בודד את התא של ריבית. לאחר התא בינארי היה מבודד, לשמור את הקובץ הבינארי.הערה: מחזיק ‘alt’ תעבור במכחול של צבע החזית (שחור) לצבע הרקע (לבן). להמיר את התא בינארי חלוקה לרמות באמצעות סרגל הכלים ויה תהליך | בינארית | חלוקה לרמות.הערה: ניתן להשתמש FracLac עבור J התמונה בצורות מוצק או או צורה מתווה, האמנה הנוכחית עם זאת, כדי להשתמש בצורה מתווה16. בסרגל הכלים, לפתוח את FracLac באמצעות סרגל הכלים על ידי לחיצה תוספים | פרקטל ניתוח | FracLac ובחר לפנה ס (תיבת לספור). הגדרות רשת העיצוב , הגדר Num G 4. תחת אפשרויות גרפיקה , סמן את התיבה מדדים כדי לנתח את קמור ועיגול התוחמת של התא. בסיום, בחר ב’אישור ‘.הערה: Num G הוא המספר של תיבת לספור אוריינטציות הרשת בשימוש במהלך הסריקה והוא הטווח המומלץ עבור Num G 4-12. את הגדרת Num G ואת הטווח המוצע נבדק ביסודיות ידנית FracLac16. הגדלת Num G יכול להאט באופן משמעותי חישוב פעמים. הגדרות FracLac תצטרך רק ניתן להגדיר פעם אחת בכל הפעלה. ברגע ההגדרות הוזן, לחצן הסריקה יהפוך לזמין. בחר בלחצן הסריקה להפעיל סריקה ספירת תיבת התמונה שנבחרה.הערה: הסריקה יפיק שלושה חלונות עם נתוני תפוקות: גוף, עיגול תוצאות, קובץ סיכום Count תיבת וסוגי לסרוק. החלון סוגי סריקה מכיל יומן של ההגדרות המשמשות, סטיות כסטנדרט גם אמצעים מסוימים. למטרות של פרוטוקול זה, החלון סוגי סריקה לא רגיל להיות סגור או לשמור לשימוש עתידי. בחלון הול ותוצאות של מעגל , להעתיק נתונים כל הרצוי (כלומר., צפיפות, יחס span ו מעגליות) תוצאות. בחלון הסיכום Count תיבת , להעתיק את הנתונים הרצויים (כלומר., פרקטל ממד ו- lacunarity) תוצאות. להעביר את הנתונים המועתקים בקובץ Excel או תוכנה סטטיסטית.הערה: רשימה מלאה של FracLac פלט נתונים ניתנים לאורחים, הוסברה ב FracLac עבור ImageJ ידנית16.