免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

すべての実験はによって承認され、アリゾナ大学の制度上の動物のケアおよび使用委員会と管理と実験動物の使用のための NIH ガイドラインによって確立されたガイドラインに従って実行されます。ケアは、動物の痛みや不快感を最小限に抑えるために運ばれました。安楽死方法は承認されたプロトコルによると、イソフルラン麻酔下で子宮頸の斬首で構成します。 1. ティッシュの準備 注: は、細胞の形態を維持するために固定、cryoprotected 組織サンプルでミクログリアの形態分析を実施します。以下は、準備し、直接蛍光 IHC の固定ティッシュをスライスする標準プロトコルです。 目的の実験後、標準的な実験室のプロトコルに従って、マウスまたはラットの脳を euthanized 動物から削除します。4 ° C で 24 時間 4% パラホルムアルデヒド溶液の 5 mL を 10 mL のバイアルに脳を配置します。その後洗い流し、30% ショ糖リン酸塩の 5-10 mL に場所が 4 ° C で 72 時間のためのソリューション (PBS、0.01 M) をバッファーミクロトームで、セクショニング、クライオスタットとティッシュまで-80 ° c または 4 ° C で全脳を格納します。注: このプロトコルはまだテストされていません組織のパラフィン包埋組織からスライスを使用します。 希望する切片厚および-20 ° C で (50 mM PBS、エチレング リコール、グリセリン) に対する凍害保護作用ソリューションのクライオスタットやミクロトームとストアの浮遊セクションを使用して向きに脳組織のセクション注: このプロトコル行われている正常に冠状切片厚み 200 μ m 50 μ m からまでに。ティッシュ セクションの以下より 50 μ m 厚い切片中のミクログリア プロセスの完全なスパンを捕獲しないかもしれない、IHC 染色できない抗体組織浸透による完璧な。組織断面、コロナのいずれかまたは矢状方向、この選択は調査される実験的目標と脳領域に依存します。 2. 免疫組織化学 注: 蛍光または 3, 3 ‘-ジアミノベンジジン (軽打) IHC スケルトンとフラクタル解析の手法を適用できます。次は標準的な蛍光 IHC プロトコルで、必要に応じてに代えることができます。蛍光 IHC 細胞プロセス軽く IHC と比較して優れた可視化が得られます。 4 mL バイアル (最大 15 マウス脳のセクション/バイアル) にティッシュ セクションを配置し、1 ml の PBS (0.01 M)、0.5% トリトン、0.04% ナン3室温 (23 ° C) 1 h で 10% 馬の血清に含まれるソリューションの間孵化させなさい。 部屋の温度で 3 回 PBS (0.01 M) で 5 分間洗ってください。 1 mL の PBS (0.01 M)、0.5% トリトン、0.04% ナン3を含む、(NaN3の有効性を保持する) に覆われている溶液で 72 時間室温で一次抗体 (Iba1、1:1, 000) で孵化させなさい。 部屋の温度で 3 回 PBS (0.01 M) で 5 分間洗ってください。 PBS (0.01 M)、0.5% トリトン、0.04% ナン3溶液 1 mL に 4 時間室温で覆われた二次抗体 (抗家兎 488, 1: 250) と孵化します。 部屋の温度で 3 回 PBS (0.01 M) で 5 分間洗ってください。 话スライドに脳組織切片 (数と向きの設定に基づいて) をマウントして、ソフト セット取付中をスライドに適用し、coverslip のティッシュをかぶせます。4 ° C でスライドを保存します。注: 1.5 ガラス coverslip 厚さ共焦点イメージングに必要です。高粘度では組織が圧縮されません、ベスト メディアをゆるませたマウントと比較して形態が保持されますので、ソフト セット、好ましい実装媒体です。 3. イメージング 20 X 客観的またはそれ以上を使用して z 集録機能を持つ明視野または共焦点顕微鏡を用いた脳組織切片における Iba1 陽性細胞をイメージします。注: パラメーターとソフトウェア設定をイメージング実験ですべての顕微鏡写真獲得のため一定必要があります。優れたプロセスの詳細は、40 X または X の 63 の目的を使用して取得されます。全体の顕微鏡写真や大きい顕微鏡内複数セルの投資収益率を記載スケルトン分析のプロトコルを適用することが可能です。 顕微鏡のソフトウェアに固有の適切なソフトウェア設定を使用して 8 ビット画像を取得します。メモ: 8 ビットの取得後にファイルの変換は、データ コレクションをゆがむ場合があります。 顕微鏡のソフトウェアに固有の適切なソフトウェア設定を使用してイメージの 2 μ m 間隔以上では少なくとも 30 μ m z スタックを取得します。注: 顕微鏡およびソフトウェアの X、Y、および Z 軸の画像取り込みようにします。Z スタックを増加可能性があります、および間隔は、ミクログリアの追加詳細を提供するために減らすことができます。Exchange では、イメージング時間が増加します。蛍光顕微鏡用ナイキスト サンプリング可能な場合を使用します。 Tif ファイルとして、または顕微鏡のソフトウェアに必要なすべてのファイルを保存します。 ImageJ で Tif ファイルを開くし、ツールバーを使用して、の画像をクリックしてチャンネルを分割 |カラー |チャンネルの分割との画像をクリックして画像をスタック |スタック |プロジェクト x |最大強度投影適切な場所。.Tif ファイルとして保存します。 4. 骨格分析 フィジーや ImageJ からダウンロード 。個々 のプラグインをダウンロードしてから AnalyzeSkeleton(2D/3D) 15から FracLac をダウンロード、16。注: 顕微鏡写真をスケルトンの画像に変換する全体のプロセスは、1 分未満かかります。 蛍光顕微鏡写真を使用する場合は、画像が 8 ビットを確認し、最高すべて陽性を視覚化するグレースケールに変換します。ツールバーを使用して、画像をクリックして |ルックアップ テーブル |グレー。FFT 帯域通過フィルターのプラグインである軽打の明視野の写真、最初の使用を使用している場合 (プロセスをクリックして、ツールバーを使用して |FFT |バンドパス フィルター) グレースケールに変換します。注: この議定書の目的のため ImageJ FFT バンドパス フィルターの既定の設定は、十分な (最大 40、ないストライプ抑制までの 3 ピクセル フィルター) です。FFT のバンドパス フィルターを適用する画像の全面的でより大きい側面を維持しながらノイズ (小特集) を削除します。これは明視野画像に特に有用、分割組織に亀裂することができます背景として表示され、従って18スケルトン分析を複雑にして。 画像が暗すぎる、ミクログリアのプロセスを可視化することはできない場合は、明るさとコントラストを調整します。ツールバーを使用して、画像をクリックして |調整 |明るさ/コントラスト。ヒストグラムがさらにエッジまで、必要に応じて、最小値または最大スライダーを調整します。注: ImageJ で明るさとコントラストが更新する変更イメージのルックアップ テーブル (LUT)、ピクセルの値が変更されていないので。最大と最小のスライダーは、現れる白 255 を超えるピクセル値とピクセル値 0 黒18を表示の下で、表示範囲の上限と下限の制限を制御します。蛍光顕微鏡写真の場合最大スライダーを使用最小スライダーは DAB 染色ミクログリアの顕微鏡写真に使用するのに対し。 さらにプロセスをクリックして、ツールバーを使用してコントラストを増加するアンシャープ マスク フィルターを実行 |フィルター |アンシャープ マスク。ImageJ の既定の設定は、この議定書の目的のため (3 のピクセル半径 0.6 の重量をマスクと) 使用されます。注: アンシャープ マスク シャープにしぼやけてバージョンの元からイメージ (アンシャープ マスク) を減算すること、元の画像の高コントラストのバージョンと結果の画像をマージによってイメージのエッジ機能を強化します。したがって、アンシャープ マスク フィルターの詳細を作成しません、むしろイメージで既存の詳細を明らかにします。設定変更どのようにぼやけてのアンシャープ マスク半径になります (およびしたがって、どのくらいのぼかしが削除されます)、およびマスク重量設定が変更にアンシャープ マスクがマージされるコントラストの程度 (およびこうして最終的なイメージのコントラストを調整します)。 アンシャープ マスクによって生成されたごま塩ノイズを除去するノイズ除去の手順を実行します。ツールバーを使用して、プロセスをクリックして |ノイズ |輪郭以外をぼかす。注: 輪郭以外をぼかす 3 × 3 近所の中央値で各ピクセルを置き換えてごま塩ノイズを削除します。効果は、強度の外れ値がエッジ18の鋭さに影響を与えずに中央のピクセルで置換されます。 画像をの画像をクリックして、ツールバーを使用してバイナリに変換 |調整 |しきい値。注: 閾値背景対興味の機能に複数のグレースケール画像を層別化するし、バイナリ18に画像を変換します。 閉じる-ノイズ除去を適用して外れ値関数を削除: 結果のバイナリ イメージである可能性があります単一ピクセル バック グラウンド ノイズ、プロセス間のギャップ。 プロセスをクリックして、ツールバーを使用してノイズ関数を適用する |ノイズ |輪郭以外をぼかす。注: を適用するバイナリに輪郭以外をぼかすイメージは、任意の残りの単一ピクセルのノイズを削除します。 プロセスをクリックして、ツールバーを使用して、close 関数を適用 |バイナリ |近くに。注: 最大 2 ピクセル単位で区切られます場合、このプラグインは 2 つの暗いピクセルを接続します。 プロセスをクリックして、ツールバーを使用して削除外れ値関数を適用する |ノイズ |外れ値を削除。注: この議定書の目的のため明るい外れ値は 2 ピクセルの半径としきい値が 50 の目標は。このプラグインは、それ以上の特定の値 (閾値) の18で外れる場合に周辺地域の中央のピクセルによって明るいまたは暗い外れ値ピクセルを置き換えられます。 将来使用するフラクタル分析のための別のファイルとしてイメージを保存し、プロセスをクリックして、ツールバーを使用してイメージを収縮 |バイナリ |収縮。 スケルトンのイメージを選択し、プラグインのプラグインをクリックしてツールバーを使用して AnalyzeSkeleton(2D/3D) を実行 |スケルトン |骨格を分析、分岐情報ボックスをチェックします。注:、画像処理、追加または上記の推奨される手順の削除による最適化が必要そうです。この過程で、スケルトンの画像はスケルトンと元のイメージのオーバーレイを作成することによって精度の評価されます。細胞体の中心から発せられるプロセスで単一の起源ポイントをする必要があります。円形細胞体データを混乱させるとプロトコルの調整を避けるべきであります。円形細胞体対単一の起源のポイントの例を図 1に示します。 一般的な問題と推奨される解決策の代表でないスケルトンの結果: あまりにも薄暗いイメージ: グレースケールに変換する、明るさ/コントラスト スライダーを調整、アンシャープ マスクを適用 あまりにも多くの背景: 明るさ/コントラスト スライダーを調整、ノイズ除去、適用および/または外れ値を削除 (特に蛍光画像) のスケルトン画像の円形細胞体: FFT 形バンドパス フィルターやアンシャープ マスクの適用 (特に明視野画像) のための組織におけるき裂: FFT 形バンドパス フィルターの適用および/または輪郭以外をぼかす 結果からすべてのデータをコピーおよび分岐情報出力し、Excel スプレッドシートにデータを貼り付けます。 Excel では、IHC と画像に起因するスケルトンのフラグメントを削除するデータをトリミングします。 スケルトン分析から出力される生データと実験ブックを複製し、ファイル名にトリムを追加します。将来の使用と参照用の生データを保持する複製されたブックですべてのそれに続くデータ トリミングが発生します。 フラグメントの長さは、ImageJ でスケルトンの画像を開き、[線] ツールを選択するデータセットから除去されますを決定します。平均の長さのメモを取る、いくつかの断片を測定し、カットオフ値を決定します。注: ここで表示されるデータのため、不要なフラグメントのカットオフ長さは 0.5 です。この値はデータセット全体にわたって一貫性のあるになります。 カスタム クリック並べ替え & フィルターで Excel スプレッドシートを並べ替える |ユーザー設定の並べ替え。「エンドポイント ボクセル」最大から最小にし、最小から最大”Mx 支店 pt”の新しいレベルの順に並べ替えます。 カットオフ値未満の最大の枝の長さと 2 のエンドポイントを含むすべての行を削除する(すなわち.、0.5)。イメージから収集されたエンドポイントの合計数を計算するエンドポイントの列のデータを合計します。 支店情報データの繰り返し: 最大から最小「枝の長さ」で並べ替えます。データをスクロールし、カットオフ値未満の枝の長さを持つすべての行を削除する(すなわち.、0.5)。イメージから収集したすべての支店の合計の長さを計算する支店長の列の値を合計します。 すべてのデータのトリミングおよび要約を完了するまですべての画像/シートの手順 4.11.3-4.11.5 を繰り返します。 対応するイメージのミクログリア細胞体の数によって (エンドポイントの数の合計し、枝の長さの合計) それぞれのイメージからデータを分割します。統計ソフトウェアに最終的なデータ (エンドポイント/セル ・支店長/セル) を入力します。注: 合計支店長/セルのデータは、ピクセル単位の長さからミクロンへの変換を必要があります。 5. フラクタル解析 注: FracLac は、このプロトコルではカバーされていない異なる形状分析の数を実行することです。FracLac の詳細な説明のさまざまな機能で FracLac のマニュアルを参照してください と関連する参照2,16,19。フラクタルは、プロトコル手順 4.1 4.7 上記を利用しています。 すべてのフラクタル解析に使用する ROI のサイズを決定します。四角形ツールを使用して、投資収益率を描きます。ボックス セル全体をキャプチャするのに十分な大きさは、データセットにわたって一貫性を維持することができることを確認します。注: は、すべて・ ロワが同じ大きさで分類された四角形のセルが同じスケールを持っているため、ことを確認するのにフリーハンドの選択ではなく、四角形の選択範囲を使用します。ImageJ は自動スケール セルに異なるスケールの異なるサイズの長方形窓に合わせて正方形 ROI のでフリーハンドの選択が使用された場合は、このケースとは言えません。フラクタル図形はスケールに依存しない、ImageJ の FracLac を使用してフラクタル解析プロセスはスケール16に依存です。したがって、データ コレクション全体で一貫したサイズの投資収益率の必要性があります。 顕微鏡写真と各対応するバイナリ イメージのフラクタル解析におけるミクログリアがランダムに選択します。ROI マネージャー] ウィンドウでセルの位置に投資収益率をロックする更新プログラムを選択します。新しいウィンドウとして ROI 内の領域を複製するCtrl + Shift + Dを使用して、トリミングされたセルを保存します。(スケルトン分析) から対応する画像の ROI マネージャーを使用して、同じセル領域を重複してください。十分な細胞数フラクタル解析のためにランダムに選択されているし、すべてのファイルを保存するまでを繰り返します。注: 乱数ジェネレーター、番号の付いたグリッド セルをランダムに選択する使用できます。 個々 のセルのバイナリ イメージを開きます。[ペイント ブラシ] ツールをダブルクリックし、色を黒に設定必要に応じて、ブラシの幅を調整します。一致する顕微鏡写真を参考にして、隣接する細胞プロセスを削除し、断片化されたプロセスに接続する興味のセルを分離絵筆を使用します。バイナリのセルが孤立している、一度は、バイナリ ファイルを保存します。注: ‘alt’ を保持している背景色 (白) を前景の色 (黒) から絵筆を切り替えられます。 バイナリのセルをプロセス経由でツールバーを使用してアウトラインに変換 |バイナリ |概要。注: 画像 J の FracLac はどちらのソリッド図形で使用できるまたは図形の概要、現在のコンベンションは、16の概要図形を使用します。 ツールバーで、プラグインをクリックしてツールバーを使用して FracLac を開く |フラクタル解析 |FracLac BC (ボックス カウント)を選択します。グリッド デザイン設定でNum Gを 4 に設定します。[グラフィックオプション] 凸包とセルの外接する円を分析する統計情報をチェックします。終了したら、 [ok]を選択します。注: Num G ボックス スキャン中に使用されるグリッド方向をカウント数、数 G の推奨範囲は 4-12。Num G 設定と推奨される範囲を徹底的に FracLac マニュアル16のレビューします。Num G を増やす計算時間が著しく低下することができます。FracLac 設定は、セッションごとに 1 回設定するだけ必要があります。設定を入力すると、スキャン ボタンは可能になります。 選択したイメージのボックス カウントのスキャンを実行し、スキャンボタンを選択します。注: スキャン データ出力の 3 つのウィンドウが生成されます: 船体とサークルの結果、ボックス カウント概要ファイル、およびスキャンの種類。スキャンの種類] ウィンドウに使用される設定のログが含まれています, 同様に標準偏差が特定の測定します。このプロトコルのため、スキャンの種類] ウィンドウを使用しないと閉鎖または将来の参考のために保存します。 船体とサークルの結果ウィンドウで、必要なすべてのデータをコピー (すなわち。、密度、スパン比と真円度) 結果。ボックス カウントの概要] ウィンドウで、目的のデータをコピー (すなわち。、フラクタル次元とベクトル) 結果。コピーしたデータを転送すると、Excel ファイルまたは統計解析ソフトウェア。メモ: FracLac の完全なリストは出力データは、ImageJ マニュアル16FracLac で徹底的に説明されています。