Summary

Une méthode pour la mesure de la fonction des glandes salivaires chez les souris

Published: January 25, 2018
doi:

Summary

Hypofonction de la glande salivaire est une conséquence fréquente du traitement de la maladie et le rayonnement auto-immune. L’évaluation reproductible de fonction des glandes salivaires chez les modèles murins de ces maladies est un défi technique. Ici, on décrit une méthode simple pour la mesure précise et reproductible de la production de salive chez les souris.

Abstract

Les patients atteints du syndrome de Sjögren, une maladie auto-immune affectant les glandes exocrines, développent une inflammation des glandes salivaires et ont réduit la production de salive. De même, la production de salive est gravement compromise chez les patients recevant des traitements de radiothérapie pour les cancers de la tête et du cou. Les modèles de rongeurs, mis au point pour imiter ces conditions cliniques, facilitent la compréhension de la pathogenèse de la maladie et permettant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, la capacité pour mesurer la fonction des glandes salivaires chez les modèles animaux avec précision, de façon reproductible et à plusieurs reprises est essentielle. S’appuyant sur des procédures décrites précédemment dans la littérature, a développé une méthode qui remplit ces critères et a été utilisé pour évaluer la fonction des glandes salivaires chez les souris. Un autre avantage de cette nouvelle méthode est qu’elle est facilement maîtrisée et a peu de variation entre opérateurs. Fonction des glandes salivaires est évaluée comme la quantité (poids ou volume) ou le taux (mL/min) de la salive produite en réponse à la stimulation de la pilocarpine. La salive est une bonne source pour l’analyse de la teneur en protéines, les concentrations de l’immunoglobuline et autres biomolécules.

Introduction

Les glandes salivaires produisent la salive en réponse à divers stimuli neurologiques et mécanique1. Les stimuli sont transportés à travers le système nerveux sympathique et parasympathique sur les récepteurs adrénergiques et cholinergiques dans la glande. Pilocarpine est un agent cholinergique, para-sympathomimétique qui agit principalement sur les récepteurs muscariniques. Dans la glande salivaire, il induit la production de salive en agissant sur les récepteurs muscariniques de l’acétylcholine M31. La production de salive après l’administration de pilocarpine est un indicateur de la capacité des glandes salivaires à répondre à la stimulation et est couramment utilisée comme mesure de la fonction des glandes salivaires.

Une mesure précise de la production de salive est critique dans l’étude des maladies des glandes salivaires, y compris le syndrome de Sjögren2 et rayonnements des blessures suite de traitement du cancer de tête et le cou3. Plusieurs méthodes différentes ont été développées pour mesurer la production de salive chez les rongeurs. Il s’agit de canulation directe du excréteur salivaire conduit4, la collecte de salive de la cavité buccale sous vide5et la collection à l’aide de capillaires de verre6 ou une micropipette7,,8, 9. direct canulation du canal salivaire fournit la plus exacte et pure de salive. Toutefois, il s’agit d’une procédure techniquement difficile, et le potentiel de causer des lésions canalaires n’empêche collections répétitives de salive de l’animal même. Collecte de salive sous vide peut conduire à des résultats variables en raison de l’assèchement de la salive dans le tube. Cette perte est encore exagérée chez les souris avec diminution de la salivation. Capillaires en verre permettent la collecte de salive pour les analyses suivantes, cependant, changements de viscosité de la salive sécrétée dans l’état du malade permet un remplissage efficace du capillaire. Plus loin, tentatives de balayer la cavité buccale afin de recueillir la salive résiduelle peuvent entraîner blessures. La méthode de la pipette permet de collection complète, et pour le même opérateur, il est remarquablement constant entre les expériences. Toutefois, pour des raisons inconnues, cette méthode montre une variation importante entre les différents opérateurs. Par conséquent, pour permettre des comparaisons appropriées, il devient impératif que le même opérateur effectue toutes les expériences liées à un projet spécifique. De toute évidence, il s’agit d’un inconvénient majeur pour un laboratoire.

Pour surmonter ces problèmes, il a développé une méthode que les méthodes de collecte de salive combine utilisé pour les humains et les rongeurs. La méthode de l’écouvillon, décrite ci-dessous pour mesurer le volume de salive induite par la pilocarpine est simple, reproductible, non influencé par l’opérateur et peut être effectuée à plusieurs reprises chez le même animal. En outre, il permet de recueillir la salive pour les analyses subséquentes des protéines, les immunoglobulines ou les autres biomolécules.

Protocol

Le protocole décrit ci-après a été approuvé par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier et il suit les directives éthiques établies par le National Institutes of Health. Toutes les données présentées dans ce rapport ont été générées en utilisant des souris femelles qui étaient de 10-12 semaines d’âge. La suite de variétés de souris ont été utilisée : C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S et F1 (B6XA/J). Toutes les souris ont été logés dans des cages de barrière (5 animaux par cage) da…

Representative Results

Dans les systèmes de modèle expérimental de souris, la capacité à produire de la salive en réponse à la stimulation de la pilocarpine est utilisée comme un indicateur de fonction des glandes salivaires. La production de salive a été mesurée chez des souris femelles C57BL/6 11 semaines par la méthode de l’écouvillon. Dans la Figure 1 a, les résultats sont exprimés comme la quantité de salive (mg) recueillie suite à des doses croissantes de l…

Discussion

La production de salive est un processus complexe et dépend de nombreux facteurs. Par conséquent, la fonction des glandes salivaires chez les animaux de laboratoire de mesure peut être un défi. Un autre défi est que des mesures répétées de la fonction des glandes salivaires chez le même animal sont tenus d’établir l’apparition de la maladie ou de démontrer la récupération après un traitement.

L’écouvillonnage décrite dans le présent rapport est techniquement simple à r?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’étude a été financée par une subvention du National Institutes of Health, National Institute of Dental and Craniofacial Research (DE025030).

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA B21410 Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Mix solution Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride) Vet One, Boise, Idaho, USA C3N VT1 Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine) Med-Vet International, Mettawa, IL, USA RXANASED-20 Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline Vet One, Boise, Idaho, USA 501032 Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) Henry Schien, Dublin, OH, USA 48272 Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name Company Catalog Number Comments
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA N/A Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes VWR, Radnor, PA, USA 89004-364 Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-290 Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 324702
18 gauge regular bevel needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 305195
Sterile scalpel blade #11 Integra York Inc PA, USA 4-311
Microdissecting forceps Roboz, Gaithersburg, MD, USA RS-5139 Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA sc-224487
3 channel timer Amazon.com, Seattle, WA, USA B06W2KCYVN
Analytical Balance Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS Invivogen, San Deigo, CA, USA tlrl-b5lps Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant Thermo Scientific 77161 Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum Generated in lab Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA E-22013 Used as per manufacturer's instructions
Name Company Catalog Number Comments
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 0106-01 Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-01 Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-05 Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 555214 Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates Thermo Scientific, Rochester, NY, USA 3855
Name Company Catalog Number Comments
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad, Hercules, CA, USA 5000006 For protein estimation as per manufacturer's instructions

Referencias

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Citar este artículo
Bagavant, H., Trzeciak, M., Papinska, J., Biswas, I., Dunkleberger, M. L., Sosnowska, A., Deshmukh, U. S. A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice. J. Vis. Exp. (131), e57203, doi:10.3791/57203 (2018).

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