Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos
Summary
Hipofunção das glândulas salivares é uma consequência frequente da terapia de radiação e doença auto-imune. Reprodutível avaliação da função da glândula salivar em modelos do rato destas doenças é um desafio técnico. Aqui, um método simples para a medição exata e reproduzível da produção de saliva em camundongos é descrito.
Abstract
Pacientes com síndrome de Sjögren, uma doença auto-imune que afectam as glândulas exócrinas, desenvolvem a inflamação das glândulas salivares e reduziram a produção de saliva. Da mesma forma, a produção de saliva é severamente comprometida em pacientes recebendo tratamento com radiação para câncer de cabeça e pescoço. Modelos de roedores, desenvolvidos para imitar essas condições clínicas, facilitam uma compreensão da patogênese da doença e permitam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Portanto, a capacidade de precisão reproducibly e repetidamente medir a função da glândula salivar em modelos animais é crítica. Base em procedimentos previamente descritos na literatura, um método foi desenvolvido que atende a esses critérios e foi utilizado para avaliar a função da glândula salivar em camundongos. Uma vantagem adicional deste novo método é que ele é facilmente dominado e tem pouca variação inter operador. Função da glândula salivar é avaliada como a quantidade (volume ou peso) ou taxa (mL/min) de saliva produzida em resposta à estimulação de pilocarpina. A saliva coletada é uma boa fonte para as análises do teor de proteínas, as concentrações de imunoglobulinas e outras biomoléculas.
Introduction
As glândulas salivares produzem saliva em resposta a uma variedade de estímulos neurológicos e mecânica1. Os estímulos são transportados através do sistema nervoso simpático e parassimpático aos receptores adrenérgicos e colinérgicos na glândula. Pilocarpina é um agente colinérgico, Pará-simpaticomimética que atua predominantemente sobre os receptores muscarínicos. Na glândula salivar, que induz a produção de saliva, agindo sobre os receptores de acetilcolina muscarínicos M31. Produção de saliva, após a administração de pilocarpina é um indicador da capacidade de responder à estimulação das glândulas salivares e é comumente usada como uma medida da função da glândula salivar.
Medição da produção de saliva é fundamental no estudo de doenças das glândulas salivares, incluindo Síndrome de Sjögren2 e lesão de radiação de tratamento de câncer cabeça e pescoço3a seguir. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir a produção de saliva em roedores. Estes incluem canulação direta do Ducto excretor salivar4, coleta de saliva da cavidade oral sob vácuo5e coleção usando de capilares de vidro6 ou7,uma micropipeta,8, 9. direto a canulação do ducto salivar fornece saliva mais preciso e puro. No entanto, este é um procedimento tecnicamente desafiador, e o potencial para causar lesão ductal impede a coleções de saliva repetitiva do mesmo animal. Coleta de saliva sob vácuo pode levar a resultados variáveis devido à secagem da saliva do tubo. Esta perda é mais exagerada em camundongos com salivação reduzida. Capilares de vidro permitem a coleta de saliva para análises subsequentes, no entanto, as alterações na viscosidade da saliva secretada no estado doente impede enchimento eficiente do capilar. Além disso, as tentativas de varrer a cavidade oral para coletar saliva residual podem causar ferimentos. O método de pipeta permite a coleção completa, e para o mesmo operador, é notavelmente consistente entre as experiências. No entanto, por razões desconhecidas, esse método mostra uma variação significativa entre os diferentes operadores. Portanto, para permitir comparações apropriadas, torna-se imperativo que o mesmo operador realiza todas as experiências relacionadas a um projeto específico. Claramente, isto representa uma grande desvantagem para um laboratório.
Para superar esses problemas, um procedimento foi desenvolvido que combina métodos de recolha de saliva usada para seres humanos e roedores. O método da zaragatoa, descrito abaixo para medir o volume de saliva induzidas pela pilocarpina é simples, reprodutível, não influenciada pelo operador e pode ser executado repetidamente no mesmo animal. Além disso, permite a coleta de saliva para posteriores análises de proteínas, imunoglobulinas ou outras biomoléculas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Produção de saliva é um processo complexo e é influenciada por muitos fatores. Portanto, medir a função da glândula salivar em animais de laboratório pode ser um desafio. Um desafio adicional é que medidas repetidas da função das glândulas salivares no mesmo animal são necessárias para estabelecer o início da doença ou para demonstrar a recuperação após o tratamento.
O método da zaragatoa descrito neste relatório é tecnicamente simples para realizar com várias opções p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi suportado por um fundo do National Institutes of Health, Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referencias
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