マウスの唾液腺機能の測定法
Summary
唾液腺機能低下は自己免疫病と放射線療法の頻繁に結果です。これらの疾患のマウスモデルにおける唾液腺機能の再現性の評価は、技術的な挑戦です。ここでは、マウスの唾液の分泌の正確かつ再現可能な測定のための簡単な方法を説明します。
Abstract
外分泌腺に影響を与える自己免疫疾患シェーグレン症候群患者唾液腺の炎症を起こすし、唾液の生産を減らした。同様に、唾液の分泌は、頭頸部がんの放射線治療を受けている患者の侵害が深刻です。齧歯動物モデル、これらの臨床条件を模倣するために開発は疾患の病態の理解を容易にして新しい治療戦略の開発を可能にします。したがって、正確に、再現性をもって、繰り返し動物モデルで唾液腺の機能を測定する能力は重要です。以前文献で説明されている手順を踏まえ、方法はこれらの基準を満たしているとマウスの唾液腺機能の評価に使用されたを開発しました。この新しいメソッドの追加の利点は、それが簡単に習得し、そしてオペレーター間の変動が小さいをことです。唾液腺機能は、数量 (重量又は容積) または唾液ピロカルピン刺激に反応して生成率 (mL/分) として評価されます。採取唾液タンパク質含有量、免疫グロブリン濃度と他の生体分子の解析のためのよい源であります。
Introduction
唾液腺は、様々 な神経学的および力学的刺激1に対して唾を生成します。刺激は、腺のアドレナリン作動性およびコリン作動性受容体に交感神経と副交感神経の神経系を介して実行されます。ピロカルピンは、ムスカリン受容体に作用する主にコリン作動性、パラ交感神経エージェントです。唾液腺には、M31ムスカリン性アセチルコリン受容体に作用して唾液の生産を誘発します。ピロカルピン投与唾液の分泌唾液腺の刺激に応答する能力の指標であるし、唾液腺の機能の尺度として使用されます。
シェーグレン症候群2頭頸部がん治療3放射線障害などの唾液腺疾患における唾液の生産の正確な測定が欠かせません。齧歯動物の唾液の分泌を測定するさまざまな方法が開発されています。排泄の唾液腺導管4、5真空下で口腔内から唾液のコレクション、ガラス毛細管6またはピペット7,8,を使用して、コレクションの直接穿刺が含まれます9. 直接唾液腺導管の穿刺が最も正確かつ純粋な唾を提供します。ただし、これは技術的に挑戦的な手順、管の損傷を引き起こす可能性を排除する同じ動物から反復唾液コレクション。真空下で唾液を収集管から唾液の乾燥により、変数の結果につながることができます。この損失は、減らされた唾液を持つマウスでさらに誇張されています。ただし、病気の状態で分泌される唾液の粘度の変化により、毛細血管の効率的な充填、ガラス管許可以降の解析のための唾液のコレクション。さらに、残留唾液を収集するために口腔内を掃除しようは、怪我につながることができます。ピペット法は、完全なコレクションと同じ演算子の実験間非常に一貫しています。しかし、未知の理由のためこのメソッドは差の異なる演算子を示しています。したがって、適切に比較できるように、同じ演算子は、特定のプロジェクトに関連するすべての実験を実行することが不可欠なります。明らかに、これは実験室の主要な不利な点を表します。
これらの問題を克服するためにプロシージャを組み合わせた唾コレクション メソッドを人間および齧歯動物の使用をしました。ピロカルピン誘導唾液量を測定するため下記綿棒の方法は、簡単に再現できる、オペレーターによって影響されないと同じ動物で繰り返し実行することができます。さらに、タンパク質や他の生体分子、免疫グロブリン、以降の解析に唾液を収集できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
唾液の分泌は複雑なプロセスであり、多くの要因に影響されます。したがって、測定実験動物の唾液腺機能は、挑戦をすることができます。追加の課題は、同じ動物の唾液腺機能の繰り返し測定が病気の発症を確立する次の治療回復を示す、または必要なことです。
このレポートで説明した綿棒方法は技術的にデータを表す複数のオプションを実行する簡単です。得ら?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、国立衛生研究所、国立歯科頭蓋顔面研究 (DE025030) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referencias
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