Mancha negativa EM é uma técnica poderosa para a visualização de estrutura macromolecular, mas diferentes técnicas de coloração podem produzir resultados diferentes de forma dependente de amostra. Aqui, várias abordagens de coloração negativas são descritas em detalhes para fornecer um fluxo de trabalho inicial para combater a visualização dos sistemas desafiadoras.
Microscopia eletrônica de mancha negativa (EM) permite observação relativamente simples e rápida de macromoléculas e macromoleculares complexos através da utilização de contraste, realçando a mancha reagente. Embora limitado na resolução a um máximo de ~ 18-20 Å, mancha negativa EM é útil para uma variedade de problemas biológicos e também fornece um meio rápido de avaliar amostras para microscopia cryo-elétron (cryo-EM). O fluxo de trabalho mancha negativa é método simples; a amostra é adsorvida sobre um substrato e, em seguida, uma mancha é aplicada, apagada e secos para produzir uma camada fina de mancha densa elétron, no qual as partículas são incorporadas. Amostras individuais podem, no entanto, se comportar de forma marcadamente diferente sob diferentes condições de coloração. Isto levou ao desenvolvimento de uma grande variedade de técnicas de preparação do substrato, negativas de reagentes e grade de lavagem e mancha as técnicas de coloração. Determinar a técnica mais adequada para cada amostra individual deve ser feito em uma base caso-a-caso e microscopista deve ter acesso a uma variedade de técnicas diferentes para alcançar os resultados da mais alta qualidade mancha negativa. Protocolos detalhados para três diferentes técnicas de mancha e dois métodos de preparação de substrato diferentes são fornecidos, e é mostrado um exemplo de uma amostra que mostra resultados marcadamente diferentes dependendo do método utilizado. Além disso, a preparação de alguns reagentes comuns de coloração negativas e dois novas manchas Lanthanide-based, é descrita com a discussão sobre o uso de cada um.
Apesar da recente atenção à resolução revolução resultante de avanços significativos no cryo-elétron microscopia1 (cryo-EM), negativo mancha permanece EM uma técnica poderosa e um componente crucial da caixa de ferramentas dos elétrons microscopistas. Coloração negativa continua a ser o melhor método de avaliação rápida de uma amostra antes de otimizar as condições de cryo-grade2. O alto contraste e velocidade de preparação de grade de amostras negativas manchadas é ideal para avaliar a pureza da amostra, concentração, heterogeneidade e flexibilidade conformacional3. Muitas estruturas biologicamente informativas resultaram de reconstruções mancha negativa, apesar de resolução da técnica, limitando-se a 18 ~ Å resolução4,5,6, e algumas amostras produzem melhores resultados na mancha do que cryo-EM para uma variedade de razões,7.
Na mancha negativa EM, a partícula de interesse é adsorvida sobre a superfície de uma grade EM e envolto por uma matriz amorfa de mancha de elétron denso composta. Um alto contraste relativo é produzido entre o fundo e a partícula de interesse, com a partícula sendo menos elétron denso do que o circundante mancha8. As partículas aparecem como áreas claras por causa de seu poder de espalhamento de elétrons de baixa em relação a densa mancha circundante, que dispersa os elétrons mais e aparece mais escura. Subestruturais características de partículas podem ser deduzidas o exame pormenorizado de imagens resultantes como mancha irá penetrar qualquer fenda e produzir contraste irregular detalhe9.
O processo de coloração negativo começa com a preparação de um substrato de apoio, no qual as partículas da amostra são capturadas e a camada da mancha seca com suporte. O substrato de apoio mais comumente usado é uma camada de carbono amorfo, às vezes apoiado por uma fina camada de polivinil (por exemplo, Formvar) ou nitrocelulose (por exemplo, colódio) polímero. Estes substratos podem ser adquiridos comercialmente ou preparados em casa usando os protocolos descritos abaixo.
Depois que o substrato de apoio é preparado, a amostra pode ser aplicada, e a solução em excesso destruídos fora. As amostras devem ser suspensas em um buffer apropriado para coloração de negativo. É melhor evitar o uso de tampão fosfato e altas concentrações de sal, que podem dar origem a precipitados cristalinos que podem obscurecer o espécime. Agentes redutores, detergentes, sacarose, glicerol e altas concentrações de nucleótidos também devem ser evitadas, como eles afetam também mancha qualidade4. Quando a composição do tampão não pode ser alterada, a superfície da grelha EM com água de lavagem ou um buffer mais adequado após adsorção e antes da coloração pode reduzir a formação de buffer de artefatos relacionados e geralmente melhorar o plano de fundo da mancha. Se artefatos de reserva são suspeitos, pode ser informativo para manchar uma grade somente buffer para determinar se os componentes da reserva são a fonte dos artefatos observados.
Depois que a amostra é adsorvida e destruída e lavada, se necessário, é aplicado um reagente de coloração. Uma variedade de reagentes foram encontrados para ser eficazes manchas negativas (tabela 1), mas a mancha deve ser escolhida de acordo com a amostra. Um ‘halo’ mancha formas em torno da partícula devido a ambos o deslocamento das moléculas mancha pelas regiões hidrofóbicas da proteína e repulsão pelo acusado grupos. Portanto, a mancha deve ser escolhida de modo que o estado de protonação de quaisquer potenciais grupos carregados na proteína é o mesmo que a mancha com o pH de trabalho. Em frente de cargas na superfície da proteína pode contribuir para uma coloração positiva efeito, que, embora uma técnica útil em sua própria direita10 não está no escopo deste trabalho. Os reagentes de coloração negativos mais comumente usados são acetato de uranilo e formiato de uranilo. Estas manchas têm um tamanho de grão relativamente fino (4-5 Å)9 e fornecer imagens de alta resolução sobre outras manchas como phospho-volframos (Å tamanho de grão de 8-9)9,11, de molibdato de amónio11e alguns baseados em lantanídeos manchas de12. Formiato e acetato de uranilo também agem como um fixador, preservando muitas interações da proteína-proteína em um milésimo de segundo tempo escala13, embora o baixo pH da mancha e sua propensão para precipitar em pH fisiológico pode ser prejudicial para algumas amostras14 . Apesar de sua utilidade, os sais de uranilo também apresentam desafios logísticos como eles são tóxico e levemente radioativo, o que pode exigir tratamento especial, armazenamento, e requisitos de eliminação, o que leva alguns usuários a procurar alternativas não-radioativo.
Há uma grande variedade de métodos descritos para o preparo do substrato, o aplicativo de exemplo e a coloração das grades EM. O método mais apropriado a utilizar é dependente de amostra e pode ser difícil verificar ao abordar um novo sistema. Este manuscrito descreve dois métodos de preparo do substrato e três métodos de mancha; lado borrando flicking5e rápida descarga15. Lado-a mancha é o mais simples dos métodos descritos. O método flicking e o método de lavagem rápido são mais difíceis de implementar, mas limitar o tempo de contato da amostra com o filme de suporte antes de fixação e têm sido mostrados para melhorar a formação de mancha artefatos para algumas amostras de5. O objetivo deste manuscrito é, portanto, para fornecer um fluxo de trabalho inicial para combater a visualização dos sistemas desafiadoras por negativo-mancha EM.
Este manuscrito descreve vários métodos para a coloração negativa de amostras para microscopia eletrônica usando uma variedade de reagentes, incluindo dois reagentes romance lantanídeos (TmAc e ErAc) de coloração. Muitas das etapas do processo de coloração negativa devem ser otimizadas para amostras individuais, incluindo a escolha de mancha, a quantidade de lavagem necessária, se houver e a técnica da mancha. Este manuscrito, portanto, fornece uma base para microscopistas desenvolver seus próprios fluxos de trabalho para combater o negativo de coloração dos sistemas desafiadoras.
A escolha da mancha é altamente dependente da amostra. Amostras que são especialmente sensíveis ao pH baixo podem ser degradadas pela UA e/ou UF, apesar das propriedades fixador destas manchas19. Nestes casos, lantanídeos baseados em manchas como TmAc ou ErAc pode ser mais apropriado, embora o pH geral da preparação deve ser mantido abaixo do ponto isoelétrico da proteína para ajudar a prevenir a coloração positiva amostra. Isso pode ser feito por acidificantes a mancha com ácido acético, se necessário. Para amostras sensíveis especialmente baixo pH, aniônicas manchas tungstato ou molibdato podem ser mais eficazes. Embora estas manchas foram encontradas para induzir a formação de artefatos em alguns casos, tais como a formação de rouleaux em lipoproteína amostras de20. Novamente, o pH da mancha pode precisar ser ajustada, neste momento, acima do ponto isoelétrico da amostra, para evitar coloração positiva.
Lavagem da amostra antes da coloração pode ser necessária se o buffer no qual a amostra é mantida tem uma elevada componente de sal ou fosfato. Em muitos casos, lavagem pode ser realizada com água ultrapura mas para amostras mais sensíveis, o que podem degradar ou sofrer mudanças estruturais quando exposto a água sozinho, lavagem pode precisar ser executada com um buffer volátil de baixa força iônica8. Mesmo sob condições cuidadosamente controladas, a lavagem pode resultar em um rearranjo estrutural sobre a superfície do carbono21.
O método pelo qual uma grade está preparada em termos de adsorção de amostra, mancha e mancha pode afetar também significativamente o que é observado. O método mais apropriado é assim, mais uma vez, altamente amostra dependente. Proteína-C, por exemplo, é observada como uma estrutura globular em anel após coloração de lado-blot, mas este parece ser um artefato do processo de coloração, como revelado quando grades são preparados pelo método flicking (ou pelo método de liberação rápido) (Figura 3 ). Os métodos de irrigação flicking e rápidos, o tempo que a amostra deve interagir com o carbono apoio superfície antes de fixação é minimizado15. A amostra também experiências menos forças de menisco recuo sobre a mancha antes da fixação. Isto significa que mudanças estruturais na amostra que poderia ocorrer após o tempo de absorção prolongada sobre o filme de carbono ou através de ação capilar são minimizadas. O método de nivelamento rápido também pode ser usado para análise de tempo-resolvido de espécimes. A amostra pode ser misturada com um ligante ou aditivo dentro de uma ponta de pipeta para um conjunto de período de tempo antes da aplicação de uma grade ou momentaneamente sobre a superfície da grade antes de fixação dentro milissegundos.
A profundidade da mancha necessária para fornecer imagens ideais de um determinado espécime novo é dependente de amostra2. Se a mancha é muito rasa, moléculas podem ser danificadas pelo feixe de elétron, mas se a mancha é grossa demais características estruturais podem ser perdidas. Profundidade da mancha é influenciada por vários fatores, tais como Hidrofilia da superfície da grelha, uniformidade da camada de carbono, a quantidade de mancha aplicada à grade, o comprimento de tempo a mancha está em contato com a grade antes da mancha, a extensão da mancha e o tempo ta Kes para a grade para secar completamente. Uma grade nunca terá uma distribuição uniforme da mancha em sua totalidade e, portanto, áreas da grade apropriada para a imagem latente precisam ser selecionados cuidadosamente. Com efeito, grades muitas vezes variam em qualidade, mesmo quando preparados no mesmo dia nas mesmas condições. Um bom exemplo de como a variação na profundidade da mancha afeta o aparecimento de moléculas e a profundidade da mancha apropriado para geração de imagens é fornecida por Burgess et al5.
Apesar de negativo coloração ser um método muito versátil, rápido e simples, nem todos os espécimes biológicos são passíveis de visualização por esse método. Assemblies frágil podem recolher ou desmontar a adsorção, coloração ou secagem no grade EM22. Coloração negativa pode também levar a achatamento das moléculas e induzir orientações preferenciais de moléculas sobre o suporte de carbono filme7.
Mancha negativa é uma ferramenta valiosa para avaliação de espécimes em sua própria direita e também antes da análise de cryo-EM… mas muitas das forças físicas, que a amostra encontra-se durante o processo são mal compreendidas. Portanto, a melhor abordagem para usar é altamente dependente da amostra e deve ser determinada por tentativa e erro ao invés de ensinadas na sequência de um protocolo fixo.
The authors have nothing to disclose.
Somos extremamente gratos ao Peter Knight para discussões úteis e revisão crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer a todos os membros dos laboratórios de Neil Ranson e de Stephen Muench e o pessoal de Astbury Biostructure laboratório para debates úteis. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Europeu de investigação (FP7/2007-2013) / ERC concessão acordo 322408. Proteína-C foi produzida usando recursos fornecidos por uma concessão da British Heart Foundation (BHF PG/13/83/30485). Agradecemos também a confiança de Wellcome para equipamentos de financiamento para apoiar a microscopia eletrônica em Leeds (090932/Z/09/Z e 094232/Z/10/Z). CS é financiado por um subsídio de ISSF Wellcome Trust.
200 mesh copper EM grids | Sigma-Aldrich | G4776-1VL | Other materials and/or mesh sizes can also be used |
Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | 277908 | |
Carbon evaporator | Ted Pella Inc. | 9620 | Cressington 208 or equivalent |
Collodion solution 2% in amyl acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | |
Dumont #5 negative pressure tweezers | World Precision Instruments | 501202 | Or other tweezers as preferred |
Erbium Acetate | Sigma-Aldrich | 325570 | |
Gadolinium Acetate | Sigma-Aldrich | 325678 | |
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. | AGAR Scientific | AGG250-1 | |
Microscope slides, white frosted | Fisher Scientific | 12607976 | Or equivalent |
Parafilm | Fisher Scientific | 10018130 | Or equivalent |
Pasteur pipette (glass) | Fisher Scientific | 10343663 | Or equivalent |
Razor blade | Fisher Scientific | 11904325 | Or equivalent |
Sandpaper | Hardware store | Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested) | |
Samarium Acetate | Sigma-Aldrich | 325872 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 | |
Sodium Phosphotungstate | Sigma-Aldrich | P6395 | |
Stainless Steel Mesh, 150×150 mm (cut to size). | AGAR Scientific | AGG252 | |
Thulium Acetate | Sigma-Aldrich | 367702 | |
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods | Ted Pella Inc. | 57-10 | Or equivalent for carbon evaporator used |
Ultra pure water | |||
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Vacuum grease | Fisher Scientific | 12719406 | Or equivalent |
Whatman #1 Filter paper. | Fisher Scientific | 1001 090 | Or equivalent |
Whatman #40 filter paper | Fisher Scientific | 10674122 | Or equivalent |