Negatieve vlek EM is een krachtige techniek voor het visualiseren van macromoleculaire structuur, maar verschillende kleuring technieken wisselende resultaten kunnen produceren in een monster afhankelijke wijze. Hier zijn verschillende negatieve kleuring benaderingen in detail te bieden een eerste workflow voor het aanpakken van de visualisatie van uitdagende systemen beschreven.
Negatieve vlek elektronenmicroscopie (EM) kunnen relatief eenvoudig en snel observatie van macromoleculen en macromoleculaire complexen met behulp van contrast verbetering van vlek reagens. Hoewel beperkt in resolutie tot een maximum van ~ 18-20 Å, negatieve vlek EM is handig voor een verscheidenheid van biologische problemen en biedt ook een snelle middel om de beoordeling monsters voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). De negatieve vlek workflow is eenvoudige methode; het monster is geadsorbeerd op een substraat, dan een vlek is toegepast, uitgewist, en gedroogd om het produceren van een dunne laag van dichte vlek elektron waarin de deeltjes zijn ingesloten. Afzonderlijke monsters kunnen echter zich gedragen in sterk verschillende manieren onder variërende kleuring voorwaarden. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van een grote verscheidenheid van substraat voorbereiding technieken, negatieve kleuring van reagentia en raster wassen en technieken te bevlekken. Bepalen van de meest geschikte techniek voor elke individuele monster moet gebeuren op een case-by-case basis en een microscopist moet toegang hebben tot een scala aan verschillende technieken om de hoogste kwaliteit negatieve vlek resultaten te bereiken. Gedetailleerde protocollen voor twee verschillende substraat bereidingswijzen en drie verschillende Bevlekkende technieken worden aangeboden, en ziet u een voorbeeld van een monster dat sterk verschillende resultaten, afhankelijk van de gebruikte methode toont. Daarnaast is de voorbereiding van enkele gemeenschappelijke negatieve kleuring reagentia, en twee nieuwe Lanthanide gebaseerde vlekken, beschreven met de discussie over het gebruik van elk.
Ondanks de recente aandacht voor de resolutie vlek revolutie die voortvloeien uit de aanzienlijke vooruitgang in cryo-Elektron microscopie1 (cryo-EM), negatieve EM blijft een krachtige techniek en een essentieel onderdeel van de electron microscopists’ toolbox. Negatieve kleuring nog steeds de beste methode voor snelle beoordeling van een monster voor het optimaliseren van de cryo-raster voorwaarden2. De hoge contrast en de snelheid van raster voorbereiding van negatief gekleurd monsters maakt het ideaal voor de beoordeling van de zuiverheid van de steekproef, concentratie, heterogeniteit en conformationele flexibiliteit3. Vele biologisch informatieve structuren hebben geleid van negatieve vlek reconstructies, ondanks de techniek de resolutie beperkt tot 18 ~ Å resolutie4,5,6, en sommige monsters betere resultaten opleveren in de vlek dan cryo-EM voor een verscheidenheid van redenen7.
In negatieve vlek EM, is het deeltje van belang geadsorbeerd op het oppervlak van een EM-raster en omgeven door een amorfe matrix van elektron dichte vlek samengestelde. Een hoge relatieve contrast wordt tussen de achtergrond en het deeltje van belang, met het deeltje wordt minder dan de omliggende vlek8dichte elektron geproduceerd. De deeltjes worden weergegeven als lichtpartijen vanwege hun lage elektron verstrooiing macht ten opzichte van de dichte omliggende vlek, die de elektronen meer verstrooit en donkerder. Substructural kenmerken van deeltjes kunnen worden afgeleid uit het gedetailleerde onderzoek van de resulterende afbeeldingen als vlek zal in een spleet doordringen en onregelmatige contrast detail9produceren.
Het negatieve kleuring proces begint met de voorbereiding van een substraat van de steun waarop de monster-deeltjes zijn gevangen, en de laag van gedroogde vlek ondersteund. Het meest gebruikte ondersteuning substraat is een laag van amorfe koolstof, soms ondersteund door een dun laagje van polyvinyl (bijvoorbeeld Formvar) of nitrocellulose (bijvoorbeeld Collodium) polymeer. Deze substraten kunnen worden ingekocht commercieel of bereid in-house met behulp van de protocollen die hieronder worden beschreven.
Nadat het substraat ondersteuning is voorbereid, het monster kan worden toegepast, en de overtollige oplossing uitgewist af. Monsters moeten worden opgeschort in een geschikte buffer voor negatieve-kleuring. Het is het beste om te voorkomen dat het gebruik van fosfaatbuffer en hoge zout concentraties, die aanleiding kunnen geven tot kristallijne precipitaten dat het specimen kunnen verdoezelen. Reductoren, detergentia, sacharose, glycerol en hoge concentraties van nucleotide moeten ook worden vermeden aangezien zij ook invloed hebben op vlek kwaliteit4. Wanneer de buffer samenstelling kan niet worden gewijzigd, het oppervlak van het EM-raster met water wassen, of een meer geschikte buffer na adsorptie en voorafgaand aan kleuring kan verminderen de vorming van buffer gerelateerde artefacten en de achtergrond van de vlek in het algemeen te verbeteren. Als buffer artefacten worden verdacht, kan het informatieve om een buffer-alleen raster om te bepalen als de buffer-componenten de bron van de waargenomen artefacten zijn vlek.
Nadat het monster is geadsorbeerd, uitgewist en gewassen indien nodig, wordt een kleuring reagens toegepast. Een verscheidenheid van reagentia bleken te worden effectieve negatieve vlekken (tabel 1), maar de vlek moet worden gekozen aan de steekproef. Een ‘halo’ van vlek vormen rond het deeltje als gevolg van zowel de verplaatsing van de vlek moleculen door de hydrofobe regio’s van de eiwitten en afkeer door betalen groepen. Dus, de vlek moet zodanig worden gekozen dat de Protonering staat van potentiële geladen groepen op de proteïne hetzelfde als de vlek met een pH van de werken is. Tegenover de kosten op het oppervlak van het eiwit kunnen bijdragen aan een positieve kleuring uit te voeren, die hoewel een nuttige techniek in eigen juiste10 niet in het toepassingsgebied van dit document. De meest gebruikte negatieve kleuring reagentia zijn uranyl acetaat en uranyl formate. Deze vlekken hebben een relatief fijne korrelgrootte (4-5 Å)9 en resolutiebeelden met een hogere over andere vlekken zoals phospho-tungstates (8-9 Å korrelgrootte)9,11, ammonium molybdaat11, en sommige bieden lanthanide gebaseerde vlekken van12. Uranyl acetaat en formate ook fungeren als een fixeer, behoud van veel eiwit-eiwitinteractie op een milliseconde tijd schaal13, hoewel de lage pH van de vlek en haar neiging te precipiteren bij fysiologische pH schadelijk voor sommige monsters14 zijn kan . Ondanks hun nut geven de uranyl-zouten ook logistieke uitdagingen als ze zijn zowel giftige als mild radioactieve, waarvoor speciale hantering, opslag, kan en verwijdering eisen, waardoor sommige gebruikers niet-radioactieve alternatieven te zoeken.
Er zijn een groot aantal methoden beschreven voor de voorbereiding van de ondergrond, de voorbeeldtoepassing, en vlekken van EM rasters. De meest geschikte methode kan is monster afhankelijk en moeilijk om na te gaan bij het aanpakken van een nieuw systeem. Dit manuscript beschrijft twee methoden voor de bereiding van het substraat en drie Bevlekkende methoden; kant bevlekken flicking5en snelle afboeken van15. Zijde-bevlekken is de eenvoudigste van de beschreven methoden. Zowel de flicking methode en de snelle Afboekingsmethode zijn moeilijker te implementeren, maar beperken de contacttijd van het monster met de film van de steun voor fixatie en is aangetoond dat de vorming van vlek artefacten voor sommige monsters5verzachten. Het doel van dit manuscript is dus te bieden een eerste workflow voor het aanpakken van de visualisatie van uitdagende systemen door negatieve-vlek EM.
Dit manuscript beschrijft meerdere methoden voor negatieve kleuring van monsters voor elektronenmicroscopie met behulp van een verscheidenheid van kleurstoffen, met inbegrip van twee nieuwe lanthanide reagentia (TmAc en ErAc). Veel van de stappen van het negatieve kleuring proces moeten worden geoptimaliseerd voor afzonderlijke monsters, met inbegrip van de keuze van de vlek, hoeveelheid wassen vereist indien van toepassing, en de Bevlekkende techniek. Dit manuscript vormt dus de basis voor microscopists te ontwikkelen van hun eigen werkstromen voor de aanpak van de negatieve kleuring van uitdagende systemen.
De keuze van de vlek is zeer proeven afhankelijk. Monsters die vooral gevoelig voor lage pH zijn kunnen worden afgebroken door UA en/of UF, ondanks de kleefpoeders eigenschappen van deze vlekken19. In deze gevallen gebaseerde lanthanide vlekken zoals TmAc of ErAc wellicht meer geschikt, hoewel de totale pH van het preparaat moet worden bewaard onder de elektrisch punt van het monster eiwit om te voorkomen dat positieve kleuring. Dit kan worden bereikt door de vlek met azijnzuur verzurende indien nodig. Voor met name lage pH gevoelig monsters, kunnen anionogene wolframaat of molybdaat vlekken meer effectief zijn. Hoewel deze vlekken zijn bevonden voor het opwekken van de vorming van artefacten in sommige gevallen, zoals de vorming van rouleaux in lipoproteïne monsters20. Nogmaals, de pH van de vlek kan moeten worden aangepast, dit keer naar boven de elektrisch punt van het monster, om te voorkomen dat positieve kleuring.
Wassen van het monster vóór kleuring kan nodig zijn als de buffer waarin het model wordt beheerd een hoog zout- of fosfaat onderdeel heeft zijn. In veel gevallen, wassen kan worden uitgevoerd met ultrazuiver water maar voor gevoeliger monsters, die kunnen worden afgebroken of structurele veranderingen wanneer blootgesteld aan water alleen ondergaan, wellicht wassen met een vluchtige buffer van lage Ionische sterkte8uit te voeren. Zelfs onder zorgvuldig gecontroleerde omstandigheden, wassen kan leiden tot enkele structurele omlegging van de koolstof oppervlakte21.
De methode waarmee u een raster in termen van monster adsorptie bereidt, bevlekken en kleuring kan ook grote invloed op wat wordt waargenomen. De meest geschikte methode is dus, nogmaals, zeer proef afhankelijk. C-proteïne, bijvoorbeeld, wordt waargenomen als een bolvormige ring-achtige structuur na kant-vlek-vlekken, maar dit lijkt te worden van een artefact van de kleuring proces, zoals geopenbaard wanneer rasters worden opgesteld door de flicking methode (of door de snelle Afboekingsmethode) (Figuur 3 ). In de flicking en snelle afboekingsmethoden, de tijd die het monster heeft om te interageren met de koolstof ondersteuning oppervlak voor fixatie is geminimaliseerd15. Het monster ervaringen ook minder troepen uit de teruglopende meniscus op het bevlekken alvorens fixatie. Dit betekent dat de structurele veranderingen in het model die zouden kunnen bij langdurige absorptie tijd op de koolstof-film of via capillair actie optreden zijn geminimaliseerd. De snelle Afboekingsmethode kan ook worden gebruikt voor time-resolved analyse van specimens. Het monster kan worden gemengd met een ligand of toevoegingsmiddel binnen een pipet-tip voor een periode van tijd voordat de vordering bij een raster of slechts tijdelijk op het oppervlak van het raster voor fixatie binnen milliseconden.
De diepte van de vlek moeten verstrekken optimale beelden van een bepaald exemplaar is weer afhankelijk van de monster2. Als de vlek te ondiep is, moleculen kunnen worden beschadigd door de elektronenbundel maar als de vlek te dik is structurele kenmerken kunnen verloren gaan. Diepte van de vlek wordt beïnvloed door meerdere factoren zoals de hydrophilicity van het oppervlak van het raster, gelijkmatigheid van de carbon laag, het bedrag van de vlek toegepast op het raster, de lengte van tijd vlek in contact met het raster voorafgaand aan bevlekken is, de omvang van het bevlekken en de tijd het ta Kes voor het raster om volledig droog. Een raster zal hebben nooit een gelijkmatige verdeling van de vlek in zijn geheel en gebieden van het raster geschikt voor imaging moeten zorgvuldig worden geselecteerd. Inderdaad, rasters vaak variëren in kwaliteit zelfs wanneer voorbereid op dezelfde dag onder dezelfde omstandigheden. Een goed voorbeeld van hoe variatie in vlek diepte de vormgeving van moleculen en de diepte van de juiste vlek bepaalt voor imaging wordt verzorgd door Burgess et al.5.
Ondanks de negatieve kleuring wordt een zeer veelzijdige, snelle en eenvoudige methode, zijn niet alle biologische monsters vatbaar voor visualisatie door deze methode. Kwetsbare assemblages kunnen samenvouwen of demonteren bij adsorptie, kleuring of drogen op de EM raster22. Negatieve kleuring kan ook leiden tot afvlakking van moleculen en voorkeur oriëntaties van moleculen op de koolstof ondersteuning film7induceren.
Negatieve vlek is een waardevol instrument voor de beoordeling van de specimens in zijn eigen recht, en ook vóór de cryo-EM analyse, maar veel van de fysieke krachten die het monster tijdens het tegenkomt slecht worden begrepen. Daarom is de beste aanpak te gebruiken is zeer proef afhankelijk en moet worden bepaald door trial-and-error in plaats van na een vast protocol onderwezen.
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn Peter Knight uiterst dankbaar voor nuttige discussies en kritische evaluatie van het manuscript. We zouden graag bedanken alle leden van de Neil Ranson en Stephen Muench de labs en het personeel van de Astbury Biostructure laboratorium voor nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad (KP7/2007-2013) / ERC Grant overeenkomst 322408. C-proteïne werd geproduceerd met behulp van middelen door een subsidie van de British Heart Foundation (BHF PG/13/83/30485). Wij danken ook de Wellcome Trust for apparatuur financiering ter ondersteuning van elektronenmicroscopie in Leeds (090932/Z/09/Z en 094232/Z/10/Z). CS wordt gefinancierd door de Wellcome Trust ISSF subsidie.
200 mesh copper EM grids | Sigma-Aldrich | G4776-1VL | Other materials and/or mesh sizes can also be used |
Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | 277908 | |
Carbon evaporator | Ted Pella Inc. | 9620 | Cressington 208 or equivalent |
Collodion solution 2% in amyl acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | |
Dumont #5 negative pressure tweezers | World Precision Instruments | 501202 | Or other tweezers as preferred |
Erbium Acetate | Sigma-Aldrich | 325570 | |
Gadolinium Acetate | Sigma-Aldrich | 325678 | |
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. | AGAR Scientific | AGG250-1 | |
Microscope slides, white frosted | Fisher Scientific | 12607976 | Or equivalent |
Parafilm | Fisher Scientific | 10018130 | Or equivalent |
Pasteur pipette (glass) | Fisher Scientific | 10343663 | Or equivalent |
Razor blade | Fisher Scientific | 11904325 | Or equivalent |
Sandpaper | Hardware store | Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested) | |
Samarium Acetate | Sigma-Aldrich | 325872 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 | |
Sodium Phosphotungstate | Sigma-Aldrich | P6395 | |
Stainless Steel Mesh, 150×150 mm (cut to size). | AGAR Scientific | AGG252 | |
Thulium Acetate | Sigma-Aldrich | 367702 | |
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods | Ted Pella Inc. | 57-10 | Or equivalent for carbon evaporator used |
Ultra pure water | |||
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Vacuum grease | Fisher Scientific | 12719406 | Or equivalent |
Whatman #1 Filter paper. | Fisher Scientific | 1001 090 | Or equivalent |
Whatman #40 filter paper | Fisher Scientific | 10674122 | Or equivalent |