부정적인 얼룩 EM 고분자 구조를 시각화를 위한 강력한 기술 이지만 다른 얼룩 기법 샘플 종속 방식에서 다양 한 결과 얻을 수 있습니다. 여기 몇 가지 부정적인 얼룩 방법은 도전 시스템의 시각화를 태 클을 위한 초기 워크플로 제공 하는 자세히 설명 되어 있습니다.
부정적인 얼룩 전자 현미경 (EM) 고분자 및 대비 향상 얼룩 시 약의 사용을 통해 고분자 복합물의 비교적 간단 하 고 빠른 관측을 허용 한다. ~ 18-20의 최대 해상도에서 제한 되지만 Å, 부정적인 얼룩 EM 다양 한 생물 학적 문제에 대 한 유용 하 고 또한 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)에 대 한 샘플 평가의 빠른 수단을 제공 합니다. 부정적인 얼룩 워크플로 간단 방법; 샘플을 기판에 흡착 후 얼룩을 적용, 얼룩이, 그리고 건조 입자 포함 하는 전자 조밀한 얼룩의 얇은 층을 생산 하. 그러나 개별 샘플 수,, 착 조건 변화에 따라 현저 하 게 다른 방법으로 작동 됩니다. 이 기판 준비 기술, 시 약, 및 그리드 세척 하 고 기술을 blotting 얼룩 네거티브의 큰 다양성의 개발을 주도하 고 있다. 각 개별 샘플에 대 한 가장 적합 한 기술 결정에 사건-의해-사건을 기준으로 수행 되어야 합니다 그리고는 현미경 부정적인 얼룩을 최고의 품질 결과 달성 하기 위해 다른 기술을 다양 한 권한이 있어야 합니다. 두 개의 다른 기판 준비 방법 및 3 개의 다른 더 럽 히 기술에 대 한 자세한 프로토콜 제공 되 고 사용 방법에 따라 현저 하 게 다른 결과 보여 주는 샘플의 예 표시 됩니다. 또한, 몇 가지 일반적인 부정적인 얼룩 시 약, 및 2 개의 소설 란타넘족 기반 얼룩의 준비는 각각의 사용에 관한 토론으로 설명 되어 있습니다.
해상도에 최근 관심에도 불구 하 고 혁명 cryo 전자 현미경 검사 법1 (cryo-엠), 부정적인 중요 한 발전에서 발생 하는 강력한 기술과 전자 microscopists’ 도구 상자의 중요 한 구성 요소 안에 남아 얼룩. 부정적인 얼룩이 아직도 cryo-그리드 조건2를 최적화 하기 전에 샘플의 신속한 평가 위한 최선의 방법 남아 있다. 부정적인 스테인드 샘플의 그리드 준비의 속도 및 높은 대비 적합 샘플 순도, 농도,이 질, 그리고 구조적 유연성3을 평가 합니다. 많은 생물학으로 유익한 구조 ~ 18 Å 해상도4,,56을 제한 되 고 기술의 해상도도 불구 하 고 부정적인 얼룩 개조에서 결과 및 일부 샘플 더 나은 결과 얻을 에 이유7의 다양 한 곳을 알아내는-그들 보다 얼룩.
부정적인 얼룩 EM, 관심의 입자는 그들 격자의 표면에 흡착 이며 전자 조밀한 얼룩 화합물의 비정 질 매트릭스에 의해 덮여. 상대 고대비 배경과 주변 얼룩8보다 적은 전자 밀도 되 고 입자와 관심, 입자 사이 생산 됩니다. 입자는 그들의 낮은 전자 분산 전원 밀도 주변 얼룩을 없앤다 더 전자 나타나고 어두운 기준 때문에 밝은 영역으로 나타납니다. 입자의 substructural 기능 얼룩 어떤 틈새에 침투 하 고 불규칙 한 대비 세부9생산 결과 이미지의 상세한 시험에서 연 역 될 수 있다.
부정적인 얼룩 프로세스 지원 말린된 얼룩의 레이어는 캡처된 샘플 입자, 지원 기판의 준비와 시작 합니다. 가장 일반적으로 사용 되는 지원 기질 비정 질 탄소, 폴 리 비닐 (예: Formvar) 또는 (예를 들어 콜) 니트로 폴리머의 얇은 층에 의해 때때로 지원의 계층입니다. 이러한 기판 상업적으로 구입 하거나 자체 아래에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 준비 될 수 있습니다.
지원 기판 준비 후에 예제를 적용할 수 있습니다, 그리고 초과 솔루션에서 얼룩이. 샘플은 부정적인 얼룩이 지기를 위한 적당 한 버퍼에 정지 한다. 이 표본 애매 수 결정 침전을 야기할 수 있는 높은 소금 농도 및 인산 염 버퍼의 사용을 피하기 위해 좋습니다. 감소 시키는 대리인, 세제, 자당, 글리세롤, 그리고 뉴클레오티드의 높은 농도 또한 피해 야 한다 그들은 또한 얼룩 품질4에 영향을 미칠. 물으로 EM 격자의 표면 세척 버퍼 구성 변경할 수 없습니다 또는 더 적당 한 버퍼 흡착 후와 전에 얼룩을 줄일 수 있습니다 때 버퍼의 형성 관련 아티팩트 및 일반적으로 얼룩 배경 개선. 버퍼 유물을 의심 하는 경우 그것은 수 있습니다 버퍼 구성 요소 관찰의 원본 확인 하려면 버퍼 전용 그리드를 얼룩 유익.
샘플은 흡착, 얼룩이 있고 필요한 경우 세척, 착 색 시 약 적용 됩니다. 시 약의 다양 한 효과가 부정적인 얼룩 (표 1), 수 발견 되었습니다 하지만 얼룩 샘플에 맞게 선택 해야 합니다. ‘후광’ 얼룩 형태의 입자 주위 모두 얼룩 분자의 변위로 인해 소수 성 영역에 의해 단백질의 반발에 의해 청구 그룹. 따라서, 얼룩은 단백질에 어떤 잠재적인 청구 그룹의 protonation 상태 작업 pH에 얼룩 같은 선택 되어야 한다. 단백질의 표면에 요금이 반대 긍정적인 얼룩에 기여할 수 있는 효과는 자체 오른쪽10 유용한 방법은이 문서의 범위에서 비록. 가장 일반적으로 사용 되 부정적인 얼룩 시 약 uranyl 아세테이트 uranyl 편대는. 이 얼룩 상대적으로 미세 입자 크기는 (4-5 Å)9 인 텅스텐 산 염 (8-9 Å 입자 크기)9,11, 황화 몰 리브 덴11, 등 일부 다른 얼룩 이상 더 높은 해상도 이미지를 제공 하는 고 란타넘족 기반 12얼룩. Uranyl 아세테이트와 편대도 정착 액, 얼룩 및 생리 적인 pH에서 침전 하는 성향의 낮은 산도 일부 샘플14에 해로운 수 있지만 많은 단백질 단백질 상호 작용에는 밀리초 시간 규모13, 보존 역 . 그들의 유틸리티에도 불구 하 고 uranyl 소금 또한 물류 도전을 제시 그들은 독성 및 약간 방사성 수 필요로 특별 한 취급, 저장, 및 처리 요구 사항, 비 방사능 대안을 추구 하는 일부 사용자를 리드.
기판 준비, 샘플 응용 프로그램에 대 한 설명 및 EM 격자의 얼룩이 지기 방법의 큰 다양 한이 있다. 가장 적절 한 방법을 사용 하 여 종속 샘플 이며 때 새로운 시스템을 태 클 확인 하기 어려울 수 있습니다. 이 원고 기판 준비의 두 가지 방법을 설명 합니다 더 럽 히는 세 가지 방법; 사이드 럽, 터치5, 그리고 빠른15홍 조. 사이드 blotting 설명 하는 방법 중 가장 간단한입니다. 터치 방법 및 급속 한 물 내리는 방법은 구현 하지만 고정 하기 전에 지원 영화와 샘플의 접촉 시간을 제한 하 고 일부 샘플5얼룩 유물의 형성을 ameliorate 표시 되었습니다에 더 어렵다. 이 원고의 목표는 이렇게 부정적인 얼룩 그들에 의해 도전 시스템의 시각화를 태 클을 위한 초기 워크플로 제공 하.
이 원고에는 부정적인 얼룩 전자 현미경 시 약, 두 소설 란타넘족 시 약 (TmAc 및 ErAc)를 포함 하 여 얼룩이 지기의 다양 한 사용에 대 한 샘플의 여러 방법을 설명 합니다. 많은 부정적인 얼룩 프로세스의 단계의 얼룩, 필요한 경우, 세척 하 고 더 럽 히 기술 선택 등 개별 샘플에 대 한 낙관 되어야 한다. 이 원고는 따라서 도전적인 시스템의 부정적인 얼룩이 태 클을 위한 그들의 자신의 워크플로 개발 하는 microscopists에 대 한 기초를 제공 한다.
얼룩의 선택은 매우 종속 샘플. 특히 낮은 pH에 민감한 샘플 이러한 얼룩19의 통 속성에도 불구 하 고 UA/UF, 또는 저하 될 수 있습니다. 이러한 경우에, 란타넘족 기초 얼룩 같은 TmAc 또는 ErAc 더 적절 한 수 있습니다, 비록 긍정적인 얼룩 방지 샘플 단백질의 전자 포인트 아래 준비의 전반적인 pH 유지 되어야 합니다. 이 필요한 경우 초 산으로 얼룩을 산성화 하 여 수행할 수 있습니다. 특히 낮은 pH 과민 한 샘플에 대 한 음이온 tungstate 또는 몰 리브 덴 얼룩 더 효과적일 수 있습니다. 비록 이러한 얼룩이 발견 되었습니다 어떤 경우에 인공 물의 형성을 유도와 같은 지 단백질에 rouleaux 형성20을샘플링 합니다. 다시, 얼룩의 pH는 긍정적인 얼룩을 방지 하기 위해 샘플의 전자 포인트 이상이 시간을 조정할 수 필요가 있습니다.
세척 얼룩 이전 샘플의 경우 표본 유지 관리 하는 버퍼는 높은 소금 또는 인산 염 구성 요소가 필요할 수 있습니다. 대부분의 경우, 세척 초순 수행할 수 있습니다 하지만 수 저하 나 혼자 물에 노출 되 면 구조적인 변화를 받아야, 더 중요 한 샘플에 대 한 세척 낮은 이온 강도8의 휘발성 버퍼를 사용 하 여 수행 해야 할 수도 있습니다. 신중 하 게 통제 조건 에서도 세척 탄소 표면21에 일부 구조적 재배열 될 수 있습니다.
한 그리드 샘플 흡착, blotting과 얼룩의 관점에서 준비 하는 방법 또한 크게 무엇 관찰은 달라질 수 있습니다. 가장 적절 한 방법을 따라서, 다시, 높은 샘플 의존 합니다. 예를 들어 C-단백질, 구형 고리 모양의 구조 측면 얼룩 얼룩, 다음으로 관찰 하지만이 나타납니다 얼룩 프로세스의 아티팩트 격자 터치 방법 (또는 의해 급속 한 세 정 방법에 의해) 준비가 때 공개 (그림 3 ). 터치 하 고 빠른 세 정 방법, 샘플 탄소와 상호 작용 하는 시간 고정 하기 전에 지원 표면에서는 최소화 된15입니다. 샘플 또한 고정 하기 전에 blotting에 필사적으로 초승달 모양에서 더 적은 힘을 경험 한다. 즉, 탄소 필름에 또는 모 세관 작용을 통해 장기간된 흡수 시간에 발생할 수 있는 표본에 구조적인 변화 최소화 됩니다. 급속 한 물 내리는 방법 또한 표본 분석 시간 해결을 위해 사용할 수 있습니다. 샘플 ligand 또는 집합에 대 한 피 펫 팁 내는 첨가제와 혼합 수 밀리초 내 고정 하기 전에 그리드 화면에서 응용 프로그램을 또는 잠시 전에 시간의 기간.
얼룩 특정 견본의 최적의 이미지는 다시 샘플 종속2제공 하는 데 필요한의 깊이. 분자 전자 빔에 의해 손상 될 수 있습니다 얼룩 너무 얕은 경우에, 그러나 얼룩 너무 두꺼운 경우 구조 기능 손실 될 수 있습니다. 얼룩 깊이 그리드 표면, 탄소 층의 균일성, 그리드, 얼룩 blotting, blotting의 범위와 시간 전에 그리드 접촉은 그것의 길이에 적용 된이 얼룩의 양을의 화란 등 여러 요인에 의해 영향을 kes에 격자에 대 한 완전히 건조. 표 전체에 걸쳐 얼룩의 동등한 배급을 없을 것입니다 하 고 따라서 이미징에 대 한 적절 한 눈금 영역 신중 하 게 선택 해야. 실제로, 격자는 종종 동일한 조건 하에서 같은 날에 준비 하는 경우에 품질에서 변화 한다. 얼룩 깊이 변화에 미치는 분자와 적절 한 얼룩 깊이의 모양을 이미징 버 지 스에 의해 제공 됩니다에 대 한 좋은 예 외5.
불구 하 고 부정적인 얼룩 매우 빠르고, 다양 하 고 간단한 방법, 모든 생물 표본이이 방법으로 시각화 의무가 있습니다. 깨지기 쉬운 어셈블리 축소 하거나 얼룩 또는 EM 표22에 건조 시 흡착, 분해 수 있습니다. 부정적인 얼룩 분자의 병합 이어질 고 탄소 지원 영화7에 분자의 선호 방향 유도 또한 수 있습니다.
부정적인 얼룩 자체 오른쪽에 및 또한 cryo-EM 분석 전 표본 평가 하기 위한 유용한 도구 이지만 샘플 과정에서 발생 하는 물리적 힘의 대부분은 제대로 이해. 따라서, 사용 하는 가장 좋은 방법은 매우 종속 샘플은 고 재판 및 오류 보다는 고정 된 프로토콜에 따라 학에 의해 결정 되어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 매우 유용한 토론 및 원고의 중요 한 검토에 대 한 피터 기사 감사입니다. 우리는 유용한 토론 Astbury Biostructure 실험실 직원과 닐 Ranson의 스티븐 Muench의 실험실의 구성원 모두 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 (FP7 2007-2013 년)에 의해 투자 되었다 ERC 부여 계약 322408 /. C-단백질 영국 심장 재단 보조금 (BHF PG/13/83/30485)에서 제공 하는 리소스를 사용 하 여 제작 되었다. 우리는 또한 Wellcome 트러스트 장비 리즈 (090932/Z/09/Z 및 094232/Z/10/Z)에 전자 현미경을 지원 하기 위해 자금에 대 한 감사 합니다. CS는 Wellcome 신뢰 국제식 보조금에 의해 자금입니다.
200 mesh copper EM grids | Sigma-Aldrich | G4776-1VL | Other materials and/or mesh sizes can also be used |
Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | 277908 | |
Carbon evaporator | Ted Pella Inc. | 9620 | Cressington 208 or equivalent |
Collodion solution 2% in amyl acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | |
Dumont #5 negative pressure tweezers | World Precision Instruments | 501202 | Or other tweezers as preferred |
Erbium Acetate | Sigma-Aldrich | 325570 | |
Gadolinium Acetate | Sigma-Aldrich | 325678 | |
Mica Sheets. 75x25x0.15mm. | AGAR Scientific | AGG250-1 | |
Microscope slides, white frosted | Fisher Scientific | 12607976 | Or equivalent |
Parafilm | Fisher Scientific | 10018130 | Or equivalent |
Pasteur pipette (glass) | Fisher Scientific | 10343663 | Or equivalent |
Razor blade | Fisher Scientific | 11904325 | Or equivalent |
Sandpaper | Hardware store | Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested) | |
Samarium Acetate | Sigma-Aldrich | 325872 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 | |
Sodium Phosphotungstate | Sigma-Aldrich | P6395 | |
Stainless Steel Mesh, 150×150 mm (cut to size). | AGAR Scientific | AGG252 | |
Thulium Acetate | Sigma-Aldrich | 367702 | |
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods | Ted Pella Inc. | 57-10 | Or equivalent for carbon evaporator used |
Ultra pure water | |||
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Vacuum grease | Fisher Scientific | 12719406 | Or equivalent |
Whatman #1 Filter paper. | Fisher Scientific | 1001 090 | Or equivalent |
Whatman #40 filter paper | Fisher Scientific | 10674122 | Or equivalent |