Summary

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo è centrato sull’analisi quantitativa della complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila, che può essere utilizzato per gli studi della morfogenesi dendritica.

Abstract

Dendriti sono le proiezioni ramificate di un neurone e morfologia dentritica riflette l’organizzazione sinaptica durante lo sviluppo del sistema nervoso. Drosophila larvale arborization dentritico neuronale (da) è un modello ideale per studiare la morfogenesi di dendriti neurali e funzione del gene nello sviluppo del sistema nervoso. Ci sono quattro classi di neuroni da. Classe IV è la più complessa con un modello di ramificazione che copre quasi l’intera superficie della parete del corpo larvale. Precedentemente abbiamo caratterizzato l’effetto di mettere a tacere l’ortologo di Drosophila di SOX5 classe di complessità di un neurone arborization dentritico IV (NDAC) utilizzando quattro parametri: la lunghezza dei dendriti, l’area della superficie di copertura dendrite, il numero totale di rami e la struttura ad albero. Questo protocollo presenta il flusso di lavoro di analisi quantitativa NDAC, composto da dissezione larvale, microscopia confocale e procedure di analisi di immagine utilizzando il software ImageJ. Ulteriore comprensione da sviluppo neuronale e dei suoi meccanismi sottostanti migliorerà la comprensione della funzione di un neurone e fornire indizi circa le cause fondamentali di neurologici e disturbi dello sviluppo neurologico.

Introduction

Dendriti, che sono le proiezioni ramificate di un neurone, coprono il settore che comprende ingressi di neurone sensoriale sinaptica da altri neuroni1,2. Dendriti sono una componente importante della formazione della sinapsi e svolgono un ruolo critico nella integrazione sinaptici ingressi, così come la stimolazione elettrochimica in un neurone di moltiplicazione. Arborization dentritico (da) è un processo mediante il quale i neuroni formano nuovi alberi dendritiche e rami per creare nuove sinapsi. Lo sviluppo e la morfologia da, come la densità di ramo e modelli di raggruppamento, risultato di processi biologici multi-step e sono altamente correlati alla funzione di un neurone. L’obiettivo del presente protocollo è fornire un metodo per l’analisi quantitativa di complessità arborization neuronale dendritric in Drosophila.

La complessità dei dendrites determina i tipi di sinaptici, connettività e gli input dai neuroni di partner. Modelli di ramificazione e la densità dei dendriti sono coinvolti nell’elaborazione dei segnali che convergono sul campo dendritiche3,4. Dendriti hanno la flessibilità per la regolazione in fase di sviluppo. Per esempio, segnalazione sinaptica ha un effetto sull’organizzazione di dendrite nel neurone somatosensory durante la fase di sviluppo e nel sistema nervoso maturo5. L’istituzione di un neurone connettività si basa sulla morfogenesi e la maturazione dei dendrites. Malformazione dei dendriti è associato con alterata funzione di un neurone. Gli studi hanno indicato che l’anomalia della morfogenesi del neurone da potrebbe contribuire alle eziologie multiple malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), e morbo di Gehrig / Sclerosi laterale amiotrofica (ALS)6,7,8. Le alterazioni sinaptiche appaiono nella fase iniziale dell’annuncio, in concerto con il declino ed il danno del neurone funzione7,8. Tuttavia, le specifiche di come patologia dendrite contribuisce alla patogenesi di queste malattie neurodegenerative resta sfuggente.

Lo sviluppo dei dendriti è regolato da geni che codificano una complessa rete di autorità di regolamentazione, come la famiglia di Wnt di proteine9,10, fattori di trascrizione e ligandi su cellule recettori di superficie11,12 . Neuroni da Drosophila sono costituiti da quattro classi (classe I, II, III, IV), del quale classe IV da neuroni sono i più complessi modelli di ramificazioni e sono stati impiegati come un potente sistema sperimentale per migliore comprensione morfogenesi13, 14. Durante la morfogenesi precoce, overespressione o RNAi silenziamento di geni in neuroni di classe IV da provocare i cambiamenti nei modelli di ramificazione e dendrite potatura13. È importante sviluppare un metodo pratico per l’analisi quantitativa del arborization dentritico neuronale.

Precedentemente abbiamo indicato che il silenziamento dell’ortologo di Drosophila di SOX5, Sox102F, ha portato alla più brevi dendriti dei neuroni da e ridurre la complessità in classe IV da neuroni15. Qui, presentiamo la procedura di analisi quantitativa per la complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila. Questo protocollo, adattato dalla precedente metodologia descritta, fornisce un metodo breve per analizzare lo sviluppo dei neuroni sensoriali da. Illustra l’etichettatura immagine robusta e il neurone nel terzo instar larvale corpo muro16,17,18,19. È un protocollo prezioso per i ricercatori che desiderano studiare la NDAC e differenze inerenti allo sviluppo in vivo.

Protocol

1. preparazione sperimentale Preparare i seguenti reagenti: tampone fosfato di Dulbecco (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeide (PFA), diluita in 4% prima dell’uso; base di elastomero di silicone e dell’agente indurente; mezzo di montaggio Antifade (ad es., prolungare oro); e smalto per unghie. Preparare la seguente attrezzatura: microscopio di dissezione, due taglienti forcipe e un paio di forbici per microdissezione, un numero di pin per microdissezione…

Representative Results

I dendriti dei neuroni da sono stati etichettati da co-overexpressing GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) da soma neurale e dendritiche pergole per analisi di imaging di fluorescenza di GFP. La morfologia dei dendriti del neurone da è stato ripreso da un microscopio confocale invertito (Figura 2). I dendriti dei neuroni da sono stati rintracciati usando il software ImageJ Fiji. Il file è stato utilizzato per …

Discussion

Dendriti che innervano l’epidermide sono le regioni ingresso dei neuroni e loro morfologie determinano come informazioni viene ricevuti ed elaborati da singoli neuroni. Morfologia del dendrite di sviluppo riflette la modulazione genica dell’organizzazione di dendrite. Il Drosophila larvale da neurone del sistema nervoso periferico è un modello importante per studiare lo sviluppo di dendrite causa di: 1) la somiglianza funzionale con mammiferi11,12; 2) q…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare William A. Eimer per l’assistenza tecnica di imaging. Quest’opera è stata sostenuta da fondo cura morbo di Alzheimer [per R.E.T], il National Institute of Health [R01AG014713 e R01MH60009 a R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 di A.L.] e la National Science Foundation [NSF1455613 a A.L.].

Materials

Phosphate buffered saline(PBS) Gibco Life Sciences 10010-023
TritonX-100 Fisher Scientific 9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA) Electron Microscopy Sciences 15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent Dow Corning Corportation 3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36931
Fingernail polish  CVS 72180
Stereo microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope Nikon Eclipse Ti-E
Petri dish Falcon 353001
Forceps Dumont 11255-20
Scissors  Roboz Surgical Instrument Co RS-5611
Insect Pins  Roboz Surgical Instrument Co RS-6082-25
Microscope slides and cover slips Fisher Scientific 15-188-52

Referencias

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Citar este artículo
Wang, S., Tanzi, R. E., Li, A. Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila. J. Vis. Exp. (143), e57139, doi:10.3791/57139 (2019).

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