Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila
Summary
Dieses Protokoll konzentriert sich auf Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila, die für Studien der dendritischen Morphogenese verwendet werden können.
Abstract
Dendriten sind die verzweigten Projektionen eines Neurons und dendritischen Morphologie spiegelt synaptischen Organisation während der Entwicklung des Nervensystems. Drosophila Larven neuronalen dendritischen Arborization (da) ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese der neuronalen Dendriten und Genfunktion in der Entwicklung des Nervensystems. Es gibt vier Klassen von da Neuronen. Klasse IV ist das komplexeste mit einem verzweigten Muster, die fast den gesamten Bereich der Larven Körperwand abdeckt. Wir haben bisher die Wirkung der Stummschaltung der Drosophila Ortholog der SOX5 Klasse IV neuronalen dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) mit vier Parametern charakterisiert: die Länge der Dendriten, die Fläche der Dendrit-Abdeckung, die Gesamtzahl der Filialen und der Verzweigungsstruktur. Dieses Protokoll stellt den Workflow der NDAC Quantitative Analyse, bestehend aus Larven Dissektion, konfokale Mikroskopie und Bild Analyseverfahren mit ImageJ-Software. Weitere Einblicke in da neuronale Entwicklung und ihre zugrunde liegenden Mechanismen verbessert das Verständnis der neuronalen Funktion und Aufschluss über die grundlegenden Ursachen der neurologischen und Entwicklungsstörungen des.
Introduction
Dendriten, die die verzweigten Projektionen eines Neurons sind, umfassen das Gebiet, das das Neuron sensorischen und synaptischen Eingänge von anderen Neuronen1,2umfasst. Dendriten sind ein wichtiger Bestandteil der Synapse Bildung und spielen eine kritische Rolle bei der Integration der synaptischen Eingänge, sowie die Vermehrung der elektrochemischen Stimulation in einem Neuron. Dendritische Arborization (da) ist ein Prozess, der durch den Neuronen neue dendritischen Bäume und Äste zum Erstellen neuer Synapsen bilden. Die Entwicklung und Morphologie der da, wie dichte Verzweigung und Gruppierung Muster ergeben sich aus mehrstufigen biologischen Prozessen und sind stark korreliert zu neuronalen Funktion. Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zur quantitativen Analyse der neuronalen Dendritric Arborization Komplexität in Drosophila.
Die Komplexität der Dendriten bestimmt die synaptischen Typen, Konnektivität und Eingänge von Partner-Neuronen. Verzweigung Muster und die Dichte der Dendriten engagieren sich bei der Verarbeitung der Signale, die auf die dendritischen Feld3,4konvergieren. Dendriten haben die Flexibilität zur Anpassung in der Entwicklung. Zum Beispiel wirkt sich synaptische Signalisierung auf Dendrit Organisation im somatosensorischen Neuronen in der Entwicklungsphase und in den Reifen Nervensystem-5. Die Einrichtung der neuronalen Vernetzung stützt sich auf die Morphogenese und Reifung von Dendriten. Fehlbildung der Dendriten ist Beeinträchtigung der neuronalen Funktion zugeordnet. Studien haben gezeigt, dass die Anomalie der da Neuron Morphogenese der Ätiologie von mehreren Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Gehrig Krankheit beitragen kann / Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)6,7,8. Synaptische Veränderungen erscheinen in der frühen Phase der AD, im Konzert mit den Niedergang und die Beeinträchtigung der Neuron Funktion7,8. Die Besonderheiten wie Dendrit Pathologie, Pathogenese in diese neurodegenerativen Erkrankungen beiträgt bleibt jedoch schwer.
Die Entwicklung der Dendriten wird durch Gene reguliert, die ein komplexes Netzwerk von Regulierungsbehörden wie der Wnt-Familie von Proteinen9,10, Transkriptionsfaktoren und Liganden auf Zelle Oberfläche Rezeptoren11,12 kodieren . Drosophila da Neuronen bestehen aus vier Klassen (Klasse I, II, III, IV), von welcher, die Klasse IV da Neuronen haben die komplexesten Verzweigung Muster und als ein leistungsfähiges experimentelle System für besseres Verständnis Morphogenese13eingesetzt, 14. Während der frühen Morphogenese führen Überexpression und/oder RNAi-Stummschaltung von Genen in Klasse IV da Neuronen Änderungen in verzweigten Mustern und Dendrit Rebschnitt13. Es ist wichtig, eine praktische Methode zur quantitativen Analyse der neuronalen dendritischen Arborization zu entwickeln.
Wir haben bereits gezeigt, dass Schweigen der Drosophila Ortholog des SOX5, Sox102F, zu kürzeren Dendriten da Neuronen und reduzierte Komplexität in der Klasse IV da Neuronen15geführt. Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren der quantitativen Analyse für die neuronale dendritischen Arborization Komplexität (NDAC) in Drosophila. Dieses Protokoll, adaptiert von der vorherigen beschriebenen Methodik bietet eine kurze Methode, um die Entwicklung der sensorischen Neuronen da assay. Die robuste Bild beschriften und da Neurons in Dritte Instar Larven Körperwand16,17,18,19veranschaulicht. Es ist eine wertvolle Protokoll für Forscher, die die NDAC und Entwicklungs Unterschiede in Vivozu untersuchen wollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendriten, die die Epidermis innervieren sind die Eingabe Regionen von Neuronen und ihre Morphologien bestimmen, wie Informationen empfangen und verarbeitet von einzelnen Neuronen. Entwicklung Dendrit Morphologie spiegelt gen Modulation der Dendrit-Organisation. Die Drosophila Larven da Neuron des peripheren Nervensystems ist ein wichtiges Modell für das Studium Dendrit Entwicklung: 1) die funktionale Ähnlichkeit mit Säugetieren11,12; (2) vier Klassen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten William A. Eimer für bildgebende technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Heilung der Alzheimer Krankheit Fonds [R.E.T], das National Institute of Health [R01AG014713 und R01MH60009, R.E.T; R03AR063271 und R15EB019704, A.L.], und die National Science Foundation [NSF1455613, A.L.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
Referencias
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer’s disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer’s disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
