التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية
Summary
هذا البروتوكول يركز على التحليل الكمي لتعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية، التي يمكن استخدامها لإجراء دراسات ل morphogenesis الجذعية.
Abstract
Dendrites الإسقاطات متفرع من خلية ومورفولوجيا الجذعية يعكس المنظمة متشابك أثناء تطوير النظام العصبي. المورفولوجية اليرقات أربوريزيشن الجذعية العصبية (دا) نموذج مثالي لدراسة morphogenesis dendrites العصبية ووظيفة الجينات في تطوير الجهاز العصبي. وهناك أربع فئات من الخلايا العصبية دا. الفئة الرابعة هي الأكثر تعقيداً مع نمط المتفرعة التي تغطي المنطقة بأكملها تقريبا من الجدار الجسم اليرقات. نحن تميزت سابقا أثر إسكات أورثولوج المورفولوجية ل SOX5 على الدرجة الرابعة أربوريزيشن الجذعية العصبية التعقيد (نداك) باستخدام المعلمات الأربعة: طول dendrites، والمساحة السطحية لتغطية تغصن، إجمالي عدد الفروع، وهيكل التفريع. ويقدم هذا البروتوكول سير العمل من نداك التحليل الكمي، تتألف من تشريح اليرقات والفحص المجهري [كنفوكل]، وإجراءات تحليل الصورة باستخدام البرمجيات إيماجيج. سيتم تحسين الفهم لوظيفة الخلايا العصبية مزيد من التبصر في دا العصبية التنمية وآلياتها الأساسية وتقديم أدلة حول الأسباب الأساسية للجهاز العصبي والاضطرابات النمائية.
Introduction
Dendrites، وهي إسقاطات متفرع من خلية، تغطي الحقل الذي يشمل مدخلات العصبية الحسية ومتشابك من1،الخلايا العصبية الأخرى2. تعد مكوناً هاما لتشكيل المشبك dendrites وتلعب دوراً حاسما في إدماج المدخلات متشابك، فضلا عن الترويج لتحفيز الكهروكيميائية في خلية. أربوريزيشن الجذعية (دا) هي عملية التي تشكل الخلايا العصبية الأشجار الجذعية جديدة وفروع لإنشاء نهايات جديدة. التنمية ومورفولوجيا دا، مثل أنماط التجميع، وكثافة فرع نتيجة الخطوة متعددة العمليات البيولوجية وهي ارتباطاً وثيقا بالوظيفة العصبية. والهدف من هذا البروتوكول توفير وسيلة للتحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون ديندريتريك الخلايا العصبية في المورفولوجية.
تعقد dendrites يحدد أنواع متشابك والاتصال، ومدخلات من الخلايا العصبية شريك. أنماط التفريع وكثافة dendrites تشارك في معالجة الإشارات التي تتلاقى على3،حقل الجذعية4. Dendrites تتمتع بالمرونة للتكيف في مجال التنمية. على سبيل المثال، يشير متشابك له تأثير على المنظمة تغصن في العصبية somatosensory خلال مرحلة النمو و النضج العصبي5. إنشاء اتصال الخلايا العصبية تعتمد على morphogenesis ونضوج dendrites. تشوه dendrites مقترن تلف في وظيفة الخلايا العصبية. وقد أظهرت الدراسات أن شذوذ morphogenesis العصبية دا قد يسهم في مسببات أمراض الأعصاب متعددة، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، مرض هنتنغتون (HD)، ولو جيهريج المرض/ التصلب العضلي الجانبي (المرض)6،،من78. تظهر التعديلات متشابك في المرحلة المبكرة من الإعلان، بالتضافر مع انخفاض وضعف العصبية الدالة7،8. بيد أن التفاصيل المتعلقة بكيفية إسهام علم الأمراض تغصن المرضية في هذه الأمراض الأعصاب لا يزال بعيد المنال.
وينظم وضع dendrites الجينات ترميز شبكة معقدة من المنظمين، مثل الأسرة Wnt البروتينات9،10، وعوامل النسخ ويغاندس على مستقبلات سطح الخلية11،12 . المورفولوجية دا الخلايا العصبية تتكون من أربعة فصول (الفصل الأول والثاني الثالث، الرابع)، من الفئة التي الرابع دا الخلايا العصبية الأكثر تعقيداً في أنماط التفريع وقد استخدمت كنظام تجريبي قوية لتحسين فهم morphogenesis13، 14. خلال أوائل morphogenesis، overexpression و/أو [رني] إسكات الجينات في الصف الرابع دا الخلايا العصبية تؤدي إلى تغيرات في أنماط التفريع وتغصن التقليم13. من المهم وضع طريقة عملية للتحليل الكمي من أربوريزيشن الجذعية العصبية.
وقد أظهرنا سابقا أن إسكات أورثولوج المورفولوجية من SOX5، Sox102F، أدى إلى أقصر dendrites من الخلايا العصبية دا وتقليل التعقيد في الصف الرابع دا الخلايا العصبية15. نقدم هنا، إجراء تحليل كمي لمدى تعقيد أربوريزيشن الجذعية العصبية (نداك) في المورفولوجية. يوفر هذا البروتوكول، مقتبس من وصف المنهجية السابقة، أسلوب مختصر للاعتداء تنمية الخلايا العصبية الحسية دا. فإنه يوضح صورة قوية العلامات والعصبية دا في الثالثة الطور اليرقات جدار الجسم16،17،،من1819. هو بروتوكول قيماً للباحثين الذين يرغبون في التحقيق في نداك والفوارق التنموية في فيفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendrites التي يعصب البشرة مناطق الإدخال من الخلايا العصبية، ومورفولوجيس على تحديد كيفية تلقي المعلومات ومعالجتها بواسطة الخلايا العصبية الفردية. ويعكس التنمية تغصن مورفولوجيا التحوير الجيني للمنظمة تغصن. العصبية دا اليرقات المورفولوجية للجهاز العصبي المحيطي نموذجا هاما لدراسة التنم…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن أشكر إيمير ألف وليام للتصوير من المساعدة التقنية. هذا العمل كان يدعمها الصندوق “علاج مرض الزهايمر” [أن R.E.T]، “المعهد الوطني للصحة” [R01AG014713 و R01MH60009 إلى R.E.T؛ R03AR063271 و R15EB019704 إلى أ. ل.]، ومؤسسة العلوم الوطنية [NSF1455613 إلى أ. ل.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
Referencias
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer’s disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer’s disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
