Manejo y tratamiento del hombre europeo anguilas (Anguilla anguilla) de maduración Hormonal y criopreservación de esperma
Summary
Protocolos de criopreservación de maduración y esperma de anguila europea han sido mejorados en los últimos años. Este artículo describe el protocolo mejor disponible con gonadotropina coriónica humana (hCG) para inducir la maduración y metanol como crioprotector.
Abstract
Durante los últimos años, varios grupos de investigación han estado trabajando en el desarrollo y mejora de nuevos protocolos para el manejo de la anguila europea y la maduración. Como de sin embargo, inyecciones semanales de gonadotropina coriónica humana (hCG) han demostrado lo machos después de sólo 5-6 semanas de tratamiento, produciendo altos volúmenes de esperma de alta calidad durante varias semanas. Además, protocolos de criopreservación de espermatozoides utilizando diferentes diluyentes, crioprotectores y enfriamiento y descongelamiento veces se han descrito previamente para la anguila europea. Aquí, mostramos que Tanaka´s solución de extender puede ser utilizado directamente para la fertilización o para la criopreservación, haciendo innecesario el uso de diferentes tipos de soluciones y diluciones. Además, el uso de metanol como crioprotector hace este Protocolo fácil de usar como metanol tiene baja toxicidad y no activa el esperma. El esperma no necesita ser congelados inmediatamente después de la adición del crioprotector, y puede ser utilizado durante mucho tiempo después de ser descongelado. Por otra parte, la motilidad del esperma sigue siendo alta después de descongelar, aunque es menor que la del semen fresco. El objetivo de este trabajo es mostrar el mejor protocolo disponible para la anguila europea, manipulación, maduración y criopreservación de esperma.
Introduction
En los últimos 25 años, el número de anguila europea (Anguilla anguilla) al llegar a la Costa Europea ha disminuido constantemente en 90% 1,2,3. Hay varios factores que explican esta caída drástica como contaminación, infecciones, sobrepesca y fragmentación del hábitat. Todo esto ha tenido un profundo efecto sobre esta especie, conduce a la inclusión de la anguila europea en la Unión Internacional para la lista de conservación de la naturaleza (UICN) en peligro de extinción crítico 4. En consecuencia, el desarrollo de técnicas y protocolos para la reproducción en cautiverio es necesario.
La maduración de la anguila europea en cautividad se consigue por tratamiento hormonal 5,6,7 pero la producción de gametos en ambos sexos es difícil sincronizar 8. Aunque el desarrollo de nuevos implantes de andrógenos ha demostrado acelerar la Oogénesis en anguilas 9,10, el tiempo de maduración final en las mujeres es altamente variable y difícil de controlar 11. Por lo tanto, almacenamiento a corto plazo de esperma 12,13,14 y criopreservación de las técnicas son necesarias para la gestión de la reproducción, haciendo innecesario de sincronización de gametos 8.
Criopreservación de espermatozoides de la anguila europea ha sido desarrollada desde 2003 15,16. Varios investigadores diseñaron protocolos exitosos utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) o metanol como crioprotectores 16,17,18,19,20. Aunque ambos protocolos se han utilizado con éxito, la viabilidad de las células obtenidas de semen descongelado congelados con DMSO es menor que con metanol 20,21. Por otra parte, eel esperma se activa al contacto con el DMSO y requiere de manipulación de espermatozoides más tedioso 19, por lo tanto, el metanol es más adecuado crioprotector para que la esperma de anguila europea de DMSO.
Aquí, el protocolo para el manejo óptimo y tratamiento hormonal de la anguila europea se describirán a continuación. Además, el protocolo de criopreservación de esperma de anguila europea mejor usando metanol como crioprotector y un protocolo para la evaluación de la calidad del esperma en esta especie también se describe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el proceso completo para la criopreservación de maduración, la manipulación y el esperma de anguila europea. Las condiciones de cría descritas aquí son óptimas para la producción de altos volúmenes de esperma de alta calidad en esta especie 6,7,25y maduración rápida. El éxito de este protocolo de criopreservación y su potencial uso para la fertilización después de descongelar dependen mucho …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta publicación fue financiada por la investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea y la innovación del programa bajo el Convenio de subvención de Marie Sklodowska-Curie No 642893 (IMPRESS), la oficina de costo (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) y el centro de investigación de excelencia- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
Referencias
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