Summary

Manipulação e tratamento de macho Europeu enguias (Anguilla anguilla) para maturação Hormonal e criopreservação de esperma

Published: January 28, 2018
doi:

Summary

Protocolos de criopreservação de maturação e esperma de enguia Europeia foram melhorados nos últimos anos. Este artigo descreve o melhor protocolo disponível usando gonadotrofina coriônica humana (hCG) para induzir a maturação e metanol como crioprotetor.

Abstract

Durante os últimos anos, diversos grupos de pesquisa têm trabalhado no desenvolvimento e aperfeiçoamento de novos protocolos para o tratamento de enguia europeia e maturação. A partir de ainda, injeções semanais de gonadotrofina coriônica humana (hCG) demonstraram maturate machos após apenas 5-6 semanas de tratamento, produzindo grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade durante várias semanas. Além disso, protocolos de criopreservação de esperma usando diferentes extensores, crioprotectores e refrigeração e descongelamento vezes foram anteriormente descritas para a enguia europeia. Aqui, nós mostramos que solução de extensor de Tanaka´s pode ser usada diretamente para a fertilização ou para criopreservação, tornando desnecessária a utilização de diferentes tipos de soluções e diluições. Além disso, o uso do metanol como um crioprotetor faz este protocolo fácil de usar como metanol tem baixa toxicidade e não ativa o esperma. O esperma não precisa ser criopreservado imediatamente após a adição do crioprotetor, e pode ser usado muito tempo depois de ser descongelado. Além disso, é ainda alta motilidade espermática pós-descongelação embora seja menor do que de esperma fresca. O objetivo deste trabalho é mostrar o melhor protocolo disponível para a enguia europeia, manipulação, maturação e criopreservação de esperma.

Introduction

Nos últimos 25 anos, o número da enguia europeia (Anguilla anguilla) chegando no litoral europeu diminuíram progressivamente 90% 1,2,3. Existem vários fatores que explicam essa queda drástica, incluindo a poluição, infecções, destruição de sobrepesca e habitat. Tudo isso teve um efeito profundo sobre esta espécie, levando à inclusão da enguia europeia na União Internacional para a lista de conservação da natureza (IUCN) como em perigo crítico 4. Consequentemente, o desenvolvimento de técnicas e protocolos para a reprodução em cativeiro são necessárias.

A maturação da enguia europeia em cativeiro é alcançada pelo tratamento hormonal 5,6,7 , mas a produção de gametas em ambos os sexos é difícil sincronizar a 8. Mesmo que o desenvolvimento de novos implantes de andrógeno tem mostrado para acelerar a ovogênese em enguias 9,10, o tempo de maturação final nas fêmeas ainda é altamente variável e difícil de controlar 11. Portanto, a curto prazo armazenamento de esperma 12,13,14 e criopreservação técnicas são necessárias para a gestão da reprodução, tornando o gameta sincronização desnecessária 8.

Criopreservação de esperma de enguia europeia tem sido desenvolvida desde 2003 15,16. Vários pesquisadores projetado protocolos bem sucedidos usando dimetilsulfóxido (DMSO) ou metanol como crioprotectores 16,17,18,19,20. Embora ambos os protocolos têm sido utilizados com sucesso, a viabilidade de células obtidas de espermatozoides descongelados criopreservadas com DMSO é inferior com metanol 20,21. Além disso, a enguia esperma é ativada em contato com DMSO e requer mais tedioso esperma manipulação 19, portanto o metanol é um crioprotetor mais adequado para que o esperma de enguia europeia que DMSO.

Aqui, o protocolo de tratamento ideal e tratamento hormonal da enguia europeia será descrito abaixo. Além disso, o melhor protocolo de criopreservação de esperma de enguia europeia utilizando metanol como um crioprotetor e um protocolo para a avaliação da qualidade do esperma nesta espécie também será descrito.

Protocol

Todos os procedimentos para trabalhar com enguia europeia descrita neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de ética da experimentação do Animal na Universitat Politécnica de València, seguindo as leis espanholas e regulamentos controlando as experiências e procedimentos em animais vivos. 1. peixe de manutenção Trazer as enguias europeias para uma instalação de pesquisa e colocá-los em um aquário de 200 L com um sistema de recirculação. Uso de termostatos e refriger…

Representative Results

Esperma de 18 enguias com uma mobilidade do esperma de 70% ou superior, foi selecionado para este estudo. Os resultados mostraram uma redução em todos os parâmetros de qualidade após descongelamento comparados de esperma fresca (tabela 1 e Figura 2). Os resultados de motilidade (média ± no MEV mostrou, n = 18) mostrou uma maior motilidade total e uma motilidade progressiva no esperma fresca do que o total mobilidade e motilidade progres…

Discussion

Este protocolo descreve o processo completo para criopreservação de esperma, a manipulação e a maturação de enguia europeia. As condições de criação descritas aqui são ideais para rápida maturação e produção de grandes volumes de espermatozoides de alta qualidade nesta espécie 6,7,25. O sucesso do presente protocolo de criopreservação e seu uso potencial para a fertilização pós-descongelação dependem gran…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta publicação foi financiada pela pesquisa de Horizonte 2020 da União Europeia e o programa de inovação no âmbito do acordo de concessão de Marie Sklodowska-Curie não 642893 (IMPRESS), o escritório de custo (custo de ação FA 1205, AQUAGAMETE) e o centro de excelência em pesquisa- 1476-4/2016/FEKUT.

Materials

AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

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