Gestione e trattamento di maschio anguilla europea (Anguilla anguilla) per maturazione ormonale e crioconservazione degli spermatozoi
Summary
Protocolli per la crioconservazione di maturazione e lo sperma di anguilla europea sono state migliorate negli ultimi anni. Questo articolo viene descritto il protocollo migliore disponibile con gonadotropina corionica umana (hCG) per indurre la maturazione e metanolo come crioprotettore.
Abstract
Negli ultimi anni, diversi gruppi di ricerca hanno lavorato sullo sviluppo e miglioramento di nuovi protocolli per la gestione di anguilla europea e maturazione. Come di ancora, iniezioni settimanali di gonadotropina corionica umana (hCG) hanno dimostrato di maturate maschi dopo appena 5-6 settimane di trattamento, produzione di elevati volumi di alta qualità dello sperma durante parecchie settimane. Inoltre, protocolli di crioconservazione di spermatozoi utilizzando diversi dispositivi Extender, crioprotettori e raffreddamento e scongelamento volte precedentemente sono stati descritti per anguilla europea. Qui, indichiamo che Tanaka´s la soluzione di estensione può essere direttamente utilizzata per la fecondazione o per la crioconservazione, rendendo inutile l’utilizzo di diversi tipi di soluzioni e diluizioni. Inoltre, l’uso del metanolo come crioprotettore rende questo protocollo facile da usare come metanolo ha una bassa tossicità e non attivare lo sperma. Lo sperma non deve necessariamente essere crioconservati immediatamente dopo l’aggiunta del crioprotettore, e può essere utilizzato a lungo dopo essere scongelati. Inoltre, la motilità dello sperma è ancora alta dopo lo scongelamento anche se è più basso di quello di sperma fresco. Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare il miglior protocollo disponibile per anguilla europea la gestione, la maturazione e la crioconservazione degli spermatozoi.
Introduction
Negli ultimi 25 anni, il numero di anguilla europea (Anguilla anguilla) che arrivano al litorale europeo sono diminuiti costantemente dal 90% 1,2,3. Ci sono diversi fattori che spiegano questo drastico calo compreso le infezioni, inquinamento, distruzione di sovrasfruttamento e habitat. Tutto questo ha avuto un effetto profondo su questa specie, che l’inclusione dell’anguilla europea su Unione internazionale per la lista di conservazione della natura (IUCN) come in pericolo critico 4. Di conseguenza, lo sviluppo di tecniche e protocolli per la riproduzione in cattività sono necessarie.
La maturazione delle uova dell’anguilla europea in cattività avviene mediante trattamento ormonale 5,6,7 , ma la produzione di gameti in entrambi i sessi è difficile sincronizzare 8. Anche se lo sviluppo di nuovi impianti di androgeni è indicata per accelerare oogenesi anguille 9,10, i tempi di maturazione finale nelle femmine è ancora altamente variabili e difficili da controllare 11. Pertanto, deposito a breve termine delle tecniche di sperma 12,13,14 e crioconservazione sono necessarie per la gestione della riproduzione, rendendo gamete sincronizzazione inutili 8.
Crioconservazione di spermatozoi di anguilla europea è stato sviluppato dal 2003 15,16. Diversi ricercatori progettato protocolli successo utilizzando solfossido dimetilico (DMSO) o metanolo come crioprotettori 16,17,18,19,20. Sebbene entrambi i protocolli sono stati utilizzati con successo, l’attuabilità delle cellule ottenuti di spermatozoi scongelati crioconservati con DMSO è inferiore con metanolo 20,21. Inoltre, sperma di Anguilla è attivato il contatto con DMSO e richiede per la manipolazione di sperma più noioso 19, pertanto il metanolo è un crioprotettore più adatto per gli spermatozoi di anguilla europea di DMSO.
Qui, il protocollo per la gestione ottima e trattamento ormonale dell’anguilla europea sarà descritto di seguito. Oltre a questo, il miglior protocollo di crioconservazione di spermatozoi anguilla europea usando il metanolo come crioprotettore e un protocollo per la valutazione della qualità dello sperma in questa specie sarà anche descritto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive il processo completo per la crioconservazione di spermatozoi, la manipolazione e la maturazione di anguilla europea. Le condizioni di allevamento descritte qui sono ottimale per la produzione di elevati volumi di alta qualità dello sperma in questo specie 6,7,25e veloce maturazione. Il successo di questo protocollo di crioconservazione e suo uso potenziale per fertilizzazione dopo lo scongelamento dip…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa pubblicazione è stata finanziata dalla ricerca Orizzonte 2020 dell’Unione europea e l’innovazione del programma nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie No 642893 (IMPRESS), l’ufficio di costo (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) e il centro di ricerca di eccellenza- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
Referencias
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