En roman In Vitro Wound Healing analys för att utvärdera cellmigration
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utvärdera effekten av peptider för migration av bronkial epitelceller. Denna metod möjliggör snabba och mycket reproducerbara obtainmenten av kvantitativa uppgifter om hastigheten på cell migration och såret stängning.
Abstract
Syftet med detta arbete är att visa en ny metod för att utvärdera förmågan hos vissa immunmodulerande molekyler, såsom antimikrobiella peptider (ampere), att stimulera cellmigration. Viktigt, är cellmigration en hastighetsbegränsning händelse under sårläkning processen att återupprätta integritet och normal funktion av vävnad skikt efter skada. Fördelen med denna metod jämfört med klassisk analysen, som är baserad på en manuellt gjorda repa i en cell enskiktslager, är användningen av speciella silikon kultur skär som ger två fack för att skapa ett cellfria pseudo sår fält med en väldefinierad bredd (500 μm ). På grund av en automatiserad bild analysplattform är det dessutom möjligt att snabbt få kvantitativa uppgifter om hastigheten på såret stängning och cell migration. Mer exakt, visas effekten av två groda-hud ampere på migration av bronkial epitelceller. Dessutom ger förbehandling av dessa celler med specifika hämmare information om de molekylära mekanismerna bakom sådana händelser.
Introduction
Det är i hög grad känt att sårläkning hos djur är en grundläggande process att återupprätta integritet och normal funktion av vävnad skikt efter skada1. Trots epitelial ytor som utsätts för den yttre miljön (t.ex. huden, andningsorganen, och mage och tarm) bildar en skyddande barriär från fysiska och kemiska förolämpningar, bildandet av sår kan lätt uppstå, särskilt efter kirurgi eller mikrobiella infektioner2. Som ett exempel leder koloniseringen av lungvävnad av opportunistiska bakterie patogenen Pseudomonas aeruginosa, särskilt i lider av cystisk fibros (CF), till skador i luftvägarna epitel med åtföljande andningssvikt3, 4. Sårläkning är en komplex värd reparation mekanism att återställa en skadad vävnad5normala arkitektur. Det kännetecknas av inledande inflammation, följt av en regenerering bemyndigades epithelialization, angiogenes och vävnad remodeling med produktionen av kollagen och cell differentiering6,7,8 . Att säkerställa epitelial integritet och för att kontrollera mikrobiell spridning, producera alla levande organismer försvar molekyler, inklusive antimikrobiella peptider (ampere)9,10. Sårläkningsprocessen är mycket svårt att simulera in vitro- på grund av cellfragment och komplexa samspel mellan olika celltyper. Dock i vitro förmåga en peptid att påskynda nedläggningen av ett pseudo sår genom att stimulera migration av epitelceller är ett tecken på dess förmåga att läka en komprometterad epitel. Faktiskt, cellmigration är en hastighetsbegränsning händelse i sårläkning och studerar faktorer som kan påverka cellmigration kommer att bidra till målet terapier för förbättrad sårläkning.
Här, tillhandahålls en mycket reproducerbara experimentell analys baserat på speciella silikon kultur skär att utvärdera cell migration in vitro. Den bygger på skapandet av en 500 μm gap (pseudo såret) på en konfluenta cell enskiktslager. Cellerna i kanten av fältet konstgjorda ”sårade” börjar migrera till området cellfria, bildar nya cell cell kontakter. Kultur skäret representerar ett nytt verktyg för snabb sårläkning experiment. Två reservoarer åtskilda av en 500 μm vägg tillhandahålls, och de kan placeras korrekt i en 3 cm maträtt tallrik eller i brunnen av en 12-bra platta. Fylla varje fack insatsen med en cellsuspension tillåter celler att växa i varje utsedda området tills confluence, medan avlägsnandet av skäret kommer att skapa en ren cellfria lucka på cirka 500 μm (samma bredd som den avskiljande väggen). En ordentlig cellodlingsmedium kompletteras med en test-förening kan sedan läggas in i skålen plattan per brunn. Efteråt, gap nedläggningen kan visualiseras vid olika tidpunkter under en inverterade Mikroskop, helst en utrustad med en videokamera för bild förvärv. Slutligen, mätning av förändringar i området cell-omfattas av programmet web-baserad automatiserad bild analys kan kvantifiering av hastigheten på såret stängning och cell migration. Sammantaget är denna metod ett steg framåt när det gäller klassiska analysen, där en repa görs manuellt av öppning konfluenta cell enskiktslager med en steril nål eller en pipett tips11. Faktiskt den sista proceduren kan förstöra plast botten av skålen plattan/brunn och ytbeläggningen, skapa rynkor. Dessutom har ”sårade” området inte en väldefinierad bredd längs hela längden av klyftan, eftersom det beror mycket på trycket tillämpas av forskare på nålspetsen /. Dessutom kan rubbas cellerna bilda klumpar av levande och döda celler på kanterna av scratch; Dessutom kan spridningen av levande celler i området ”sårade” påverka hastigheten av cellmigration, genererar icke-reproducerbara resultat12.
Dessutom, tack vare en scratch bild analysplattform, kan användare snabbt få (inom minuter) kvantitativa uppgifter om flyttande beteendet för de markerade cellerna utan nödvändigheten av att förvärva ytterligare programvara. Denna plattform är kapabel att analysera fas kontrast mikroskopi bilder av låg (~ 5 X), medium (~ 10 X) och hög (~ 20 X) förstoring. Efter uppladdning en zip-fil av bilder (i *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format) sker analysen automatiskt för att generera en summary fil som visar procentandelen av både cell-täckt och scratch områden, liksom hastigheten på cell migration, vid olika tidsintervaller.
I detta arbete, med hjälp av en groda-hud AMP-derivat, dvs Esc(1-21) och dess diastereomer Esc(1-21) – 1 c13och en bronkial cellinje som uttrycker den funktionella CF transmembrane conductance regulator (CFTR)14,15, ett exempel på peptid-inducerad cellmigration jämfört med obehandlade (kontrollproven) tillhandahålls. Observera att de luftvägarna epitel och CFTR spela en avgörande roll för att upprätthålla lungfunktion och såret reparation16. Dessutom genom selektiv hämmare (t.ex. AG1478)17 av epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR), bevis att migreringen av bronkial celler induceras av ovannämnda peptiderna innebär aktivering av EGFR12, 18 redovisas.
Sammanfattningsvis är målet med detta förfarande att visa hur användningen av sådana silikon kultur skär representerar en snabb och lättillgänglig analysen att exakt fastställa migration av vidhäftande celler (t.ex., bronkial epitelceller) och molekylära mekanismer för kontroll av sådana händelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellmigration är en viktig process i många fysiologiska och patologiska händelser inklusive sårläkning, embryonal utveckling och cancer metastaser. Den grundläggande proceduren att studera cell migration i vitro innebär: (i) skapandet av en cell enskiktslager, (ii) produktionen av en pseudo såret i konfluenta lagret av celler, (iii) att fånga bilder vid olika tidpunkter tills såret stängning nås , och (iv) analys av den bildsekvens för att kvantifiera flyttning hastigheten av valda celler.
<p cl…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av finansiering från Sapienza University of Rome och italienska cystisk fibros Research Foundation (projektet FFC nr 11/2014 antogs av FFC delegationer från Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny och Pavia). En del av detta arbete fick också stöd av FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Vi är tacksamma att Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italien) för att tillhandahålla bronkial epitelceller.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
Referencias
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
