Summary

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

Published: March 17, 2018
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van het effect van peptiden op de migratie van bronchiale epitheliale cellen. Deze methode zorgt voor de snelle en zeer reproduceerbaar accumulatie van kwantitatieve gegevens over de snelheid van cel migratie en wond sluiting.

Abstract

Het doel van dit werk is om te laten zien van een nieuwe methode voor de evaluatie van het vermogen van sommige immunomodulerende moleculen, zoals antimicrobiële peptiden (ampère), ter stimulering van de cel migratie. Nog belangrijker is, is cel migratie een snelheidsbeperking evenement tijdens de wondgenezing proces te herstellen de integriteit en de normale functie van lagen weefsel na blessure. Het voordeel van deze methode ten opzichte van de klassieke bepaling, die is gebaseerd op een handmatig gemaakte kras in een cel enkelgelaagde, is dat het gebruik van speciale silicone cultuur wordt ingevoegd die twee compartimenten een cel-vrije pseudo-wond als veld wilt maken met een welomschreven breedte (500 μm ). Daarnaast, als gevolg van een geautomatiseerde beeld analyse platform is het mogelijk om snel het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de snelheid van de wond sluiting en cel migratie. Meer precies, wordt het effect van twee kikker-huid versterkers op de migratie van bronchiale epitheliale cellen getoond. Bovendien zal de voorbehandeling van deze cellen met specifieke remmers informatie verschaffen over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke gebeurtenissen.

Introduction

Het is grotendeels bekend dat wondgenezing in dieren een fundamentele proces is om opnieuw de integriteit en de normale functie van lagen weefsel na letsel1. Ondanks de epitheliale oppervlakken die zijn blootgesteld aan de externe omgeving (bijvoorbeeld de huid, luchtwegen, en gastro-intestinale traktaten) vormen een beschermende barrière van fysische en chemische beledigingen, de vorming van wonden kan gemakkelijk optreden, vooral na chirurgie of microbiële infecties2. Als voorbeeld leidt kolonisatie van longweefsel door de opportunistische bacteriële pathogenen Pseudomonas aeruginosa, met name in cystic fibrosis (CF) patiënten, tot schade aan het epitheel van de luchtwegen met daaruit voortvloeiende respiratoir falen3, 4. Wondgenezing is een complexe host reparatie mechanisme om te herstellen van de normale architectuur van een gewonde weefsel5. Het wordt gekenmerkt door een eerste ontsteking, gevolgd door een periode van de regeneratie omvat epithelialization, angiogenese, en weefsel remodeling met collageenproductie en cel differentiatie6,7,8 . Om de integriteit van de epitheliale garanderen en zo de besturing van de microbiële proliferatie, produceren alle levende organismen verdediging moleculen, met inbegrip van antimicrobiële peptiden (AMPs)9,10. De wond genezing proces is zeer moeilijk te simuleren in vitro als gevolg van het ontbreken van cel puin en complexe interacties tussen de verschillende soorten cellen. Echter de mogelijkheid in vitro van een peptide voor het versnellen van de sluiting van een pseudo-wond door het stimuleren van migratie van epitheliale cellen is kenmerkend voor haar vermogen om te genezen van een gecompromitteerde epitheel. Inderdaad, cel migratie is een snelheidsbeperking evenement in de wondgenezing en bestuderen van de factoren die van invloed kunnen zijn op de cel migratie zal bijdragen tot doel therapieën voor betere wondgenezing.

Hier, wordt een zeer reproduceerbaar experimentele bepaling verstrekt op basis van speciale silicone cultuur inzetstukken te evalueren cel migratie in vitro. Het is gebaseerd op het creëren van een 500 μm kloof (pseudo-wond) op een enkelgelaagde confluente cel. De cellen aan de rand van de kunstmatige “wounded” veld zal beginnen migreren in de cel-vrije zone, de vorming van de nieuwe cel contacten. Het invoegen van cultuur vertegenwoordigt een nieuw instrument voor snelle wond genezing experimenten. Twee reservoirs die zijn gescheiden door een muur μm 500 worden geleverd, en ze kunnen goed geplaatst worden in een plaat van 3 cm schotel of in de put van een 12-well-plate. Elk compartiment van de insert te vullen met een celsuspensie kunt cellen groeien in elke aangewezen zone tot samenvloeiing, terwijl verwijdering van het donormateriaal zal het nastreven van een schoon cel-vrije kloof van ongeveer 500 μm (dezelfde breedte als de scheidingsmuur). De juiste cel voedingsbodem aangevuld met een teststof kunnen vervolgens worden toegevoegd in de schotel plaat per putje. Daarna kan de kloof sluiting op verschillende tijdstippen onder een omgekeerde Microscoop, bij voorkeur een uitgerust met een video-camera voor Beeldacquisitie worden gevisualiseerd. Tot slot zal de meting van veranderingen in de cel bedekte gebied door de web gebaseerde image met geautomatiseerde analyseprogramma de kwantificering van de snelheid van de wond sluiting en cel migratie toestaan. Deze methode is over het geheel genomen een stap voorwaarts met betrekking tot de klassieke bepaling, waar een kras is handmatig gemaakt door confluente cel monolayers gebeuren met een steriele naald of een pipet tip11. Inderdaad, de laatste procedure op de plastic onderkant van de schotel kan vernietigen plaat per putje en de oppervlaktelaag, rimpels maken. Bovendien, het “wounded” gebied beschikt niet over een welomschreven breedte langs de gehele lengte van de kloof, zoals dit is sterk afhankelijk van de uitgeoefende door onderzoekers naar de naald/tip. Bovendien, de dislodged cellen kunnen vormen bosjes van levende en dode cellen aan de randen van de kras; Bovendien, de verspreiding van levende cellen in het “wounded” gebied kan interfereren met de snelheid van cel migratie, het genereren van niet-reproduceerbare resultaten12.

Bovendien, dankzij een kras beeld analyse platform, kunnen gebruikers snel ontvangen (in minuten) kwantitatieve gegevens over het trekgedrag van de geselecteerde cellen zonder de noodzaak van het verwerven van extra software. Dit platform is geschikt voor het analyseren van de fase contrast microscopie afbeeldingen van lage (~ 5 X), medium (~ 10 X) en hoog (~ 20 X) vergroting. Na het uploaden van een zip-bestand van beelden (in *.jpg *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff formaat) wordt de analyse automatisch uitgevoerd om een samenvatting bestand genereren dat het percentage van zowel cel bedekte gebieden en kras gebieden, alsmede de snelheid van de cel toont migratie, op verschillende tijdstippen.

In dit werk, met behulp van een kikker-huid AMP-derivaat, dat wil zeggen Esc(1-21) en haar Diastereomeer Esc(1-21) – 1 c13en een bronchiale cellijn uitdrukken van de functionele CF transmembraan huidgeleiding regulator (CFTR)14,15, een voorbeeld van peptide-geïnduceerde cel migratie in vergelijking met onbehandelde (controlemonsters) wordt verstrekt. Merk op dat het epitheel van de luchtwegen en CFTR een cruciale rol spelen bij het handhaven van de longfunctie en wond reparatie16. Bovendien, door middel van selectieve inhibitors (bijvoorbeeld AG1478),17 van de epidermale groeifactor receptor (EGFR), bewijs dat migratie van bronchiale cellen geïnduceerd door de bovengenoemde peptiden activering van EGFR12impliceert, 18 wordt gemeld.

Kortom is het doel van deze procedure om te laten zien hoe het gebruik van dergelijke siliconen cultuur inzetstukken vertegenwoordigt een snelle en gemakkelijk toegankelijke assay nauwkeurig bepalen migratie van Adherente cellen (bijvoorbeeld bronchiale epitheliale cellen) en de moleculaire mechanismen waarmee dergelijke gebeurtenissen worden bestuurd.

Protocol

1. cel voorbereiding Zaad van 2.5×106 cellen in 10 mL van Minimum essentiële Medium (MEM) aangevuld met 2 mM glutamine (MEMg), vermeerderd met 10% foetale runderserum (FBS), antibiotica (0,1 mg/mL penicilline en streptomycine) en puromycin (0,5 µg/mL voor selectie en onderhoud van de cel regel) in een maatkolf van T75. Incubeer de erlenmeyer op 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 dagen. Controleer voordat u begint het experiment, de samenvloeiing van de cellen onder een omgekeerde Microscoop.<…

Representative Results

Dit protocol werd gebruikt voor het bepalen van de wond helende effect van Esc(1-21) en Esc(1-21) – 1 c in termen van cel migratie activiteit geïnduceerd op bronchiale epitheliale cellen uiten van de functionele CFTR. In deze test, werden de cultuur inzetstukken in putjes van de plaat van een 12-well geplaatst, en elk compartiment was bezaaid met 35.000 cellen in MEMg aangevuld met 10% FBS. De cellen bereikt volledige samenvloeiing binnen 24 h. daarna, een kloof van 500 micrometer is geg…

Discussion

Cel migratie is een essentieel proces in vele fysiologische en pathologische evenementen waaronder wondgenezing, embryonale ontwikkeling en uitzaaiing van de kanker. De basisprocedure cel migratie in vitro te studeren omvat: (i) de oprichting van een cel enkelgelaagde, (ii) de productie van een pseudo-wond in de confluente laag van cellen, (iii) het vastleggen van beelden op verschillende tijdstippen tot wond sluiting is bereikt , en (iv) de analyse van de reeks van de afbeeldingen om de snelheid van de migratie…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Sapienza universiteit in Rome en de Italiaanse Cystic Fibrosis Research Foundation (Project FFC #11/2014 aangenomen door FFC delegaties van Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny en Pavia). Onderdeel van dit werk werd ook ondersteund door FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.

Wij zijn dankbaar aan Dr Loretta Ferrera (U.O.C. Genetics Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italië) voor het verstrekken van de bronchiale epitheliale cellen.

Materials

Minimal essential medium (MEM)  Euroclone ECB2071L Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine Euroclone ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0180DH 
Penicillin and Streptomycin Euroclone ECB3001D
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS Euroclone ECB3052D Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) Sigma-Aldrich D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS) Sigma-Aldrich D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well Ibidi  80209
Wimasis Image Analysis Ibidi  30002
PRISM software  GraphPad version 6.0

Referencias

  1. Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
  2. Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
  3. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
  4. Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
  5. Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
  6. Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
  7. Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
  8. Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
  9. Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
  10. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
  11. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
  12. Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
  13. Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
  14. Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
  15. Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
  16. Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
  17. Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
  18. Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
  19. Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
  20. Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).

Play Video

Citar este artículo
Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. J. Vis. Exp. (133), e56825, doi:10.3791/56825 (2018).

View Video