Summary

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

Published: March 17, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

Abstract

מטרת עבודה זו היא להציג שיטה להעריך את היכולת של מולקולות immunomodulatory, כגון מיקרוביאלית פפטידים (אמפר), כדי לעורר את נדידת תאים. חשוב לציין, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב במהלך תהליך ריפוי פצע לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה. היתרון של שיטה זו על וזמינותו הקלאסית, אשר מבוסס על שריטה עשה באופן ידני בטפט התא, הוא שהשימוש של תרבות סיליקון מיוחד מוסיף מתן שני תאים כדי ליצור שדה מדומים הפצע נטול תאים עם רוחב מוגדרים היטב (500 μm ). בנוסף, עקב פלטפורמה ניתוח התמונה האוטומטי, אפשרי להשיג במהירות נתונים כמותיים על מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. ליתר דיוק, ההשפעה של שני אמפר עור הצפרדע על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט יוצגו. יתר על כן, רעלני של תאים אלה עם מעכבי ספציפית יספק מידע על המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים כאלה.

Introduction

היא ידועה בעיקר כי ריפוי הפצע בבעלי חיים הוא תהליך מהותי לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה1. למרות אפיתל משטחים חשופים לסביבה החיצונית (למשל, העור, מערכת הנשימה, ו נרחבים במערכת העיכול) ליצור מחסום מגן מפני עלבונות פיזיקליות, כימיות, היווצרות הפצעים יכול בקלות להתרחש, במיוחד אחרי ניתוח או זיהומים חיידקים2. לדוגמה, קולוניזציה של רקמת הריאה על ידי פתוגן חיידקי הזדמנותית Pseudomonas aeruginosa, במיוחד אצל חולי סיסטיק פיברוזיס (CF), מוביל לפגיעה של האפיתל איירווייז עם כשל נשימתי הסוגר3, 4. ריפוי הפצע הוא מנגנון תיקון מארח מורכבים כדי לשחזר את הארכיטקטורה נורמלי של רקמות הפצועים5. היא מאופיינת על ידי דלקת ראשונית, ואחריו נקודה ההתחדשות המקיף epithelialization, אנגיוגנזה, ושחזור רקמות עם ייצור קולגן תא בידול6,7,8 . כדי להבטיח את תקינות אפיתל וכדי לשלוט התפשטות חיידקים, כל היצורים החיים לייצר מולקולות ההגנה, לרבות מיקרוביאלית פפטידים (אמפר)9,10. תהליך ריפוי הפצע קשה מאוד לדמות במבחנה בשל היעדר שאריות תאים ואינטראקציות מורכבים בין סוגי תאים שונים. עם זאת, במבחנה היכולת של פפטיד כדי להאיץ את הסגר על פצע מדומה על ידי גירוי נדידה של תאים אפיתל היא מעידה על היכולת לרפא האפיתל הנגוע. אכן, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב בריפוי הפצע, לומד גורמים שיכולים להשפיע על נדידת תאים יעזור היעד טיפולים לריפוי הפצע משופרת.

כאן, assay ניסיוני מאוד לשחזור מסופק המבוססת על סיליקון מיוחד תרבות מוסיף להעריך תא העברה בתוך חוץ גופית. היא מבוססת על יצירת פער μm 500 (הפצע מדומה) על טפט התא confluent. התאים בקצה השדה “הפצוע” מלאכותי יתחיל נודדות לאזור ללא תאים, ויצרו קשרים תאים תאים חדשים. הוסף תרבות מייצג כלי חדש עבור ריפוי ניסויים הפצע מהר. שני מאגרים המופרדות על-ידי קיר μm 500 הינם מסופקים, ושיחות ניתן כהלכה להניח לתוך צלחת צלחת 3-ס”מ או בבאר של צלחת 12-. טוב. מילוי כל תא של הקדמי עם השעיה התא מאפשר לתאים לגדול בכל אזור המיועד עד למפגש, בזמן ההסרה של הקדמי לעורר רווח נקי ללא תא של 500 μm (באותו רוחב כמו חומת ההפרדה). מדיום התרבות התא הנכון עם תרכובת מבחן אז ניתן להוסיף לתוך המנה לצלחת/טוב. לאחר מכן, ניתן לאבחן על סגירת הפער במרווחי זמן שונים תחת מיקרוסקופ הפוכה, רצוי אחד מצויד מצלמת וידיאו עבור ייבוא תמונות. לבסוף, מדידה של שינויים באזור המכוסה תא על-ידי התוכנית ניתוח תמונות אוטומטית מבוססת אינטרנט יאפשר כימות של מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. בסך הכל, שיטה זו היא צעד אחד קדימה ביחס וזמינותו קלאסי, בו שריטה מתבצעת באופן ידני על-ידי אם תא confluent monolayers עם מחט סטרילית או פיפטה עצה11. אכן, ההליך האחרון יכול להרוס בתחתית קערה פלסטיק צלחת/טוב, הציפוי על פני השטח, יצירת קמטים. בנוסף, האזור “הפצוע” לא קיימת רוחב מוגדרים היטב לכל אורכו של הפער, מכיוון שזה מאוד תלוי הלחץ שהופעל על ידי חוקרים המחט/טיפ. יתר על כן, התאים ונדרש שיכולים להיווצר גושים של תאים חי וגם מת בקצוות של השריטה; יתר על כן, הפצת התאים החיים לאזור “הפצוע” יכול להתערב עם המהירות של נדידת תאים, הפקת תוצאות שאינן לשחזור12.

בנוסף, הודות פלטפורמה ניתוח תמונת הטיוטה, משתמשים יכולים במהירות לקבל (בתוך דקות) נתונים כמותיים על ההתנהגות הנדידה של התאים שנבחרו ללא הצורך ברכישת תוכנות נוספות. פלטפורמה זו הוא מסוגל לנתח שלב תמונות מיקרוסקופ בניגודיות נמוכה (~ 5 X), בינוני (~ 10 X), הגדלה גבוהה (~ 20 X). לאחר העלאת קובץ zip של תמונות (ב- *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff תבנית) הניתוח מבוצע באופן אוטומטי כדי ליצור קובץ סיכום המציגה את אחוז מכוסי תא אזורים ואזורי מאפס, כמו גם המהירות של התא הגירה, במרווחי זמן שונים.

בעבודה זו, באמצעות כח-נגזרת צפרדע-עור, קרי Esc(1-21), שלה diastereomer Esc(1-21) – 1c13, קו תא הסמפונות לבטא את תפקודי CF מוליכות transmembrane הרגולטור (CFTR)14,15, דוגמה של נדידת תאים פפטיד-induced לעומת דגימות ללא טיפול (בקרה) מסופק. שימו לב כי אפיתל דרכי הנשימה ואת CFTR לשחק תפקיד מכריע בשמירה על תפקוד הריאות, פצע תיקון16. יתר על כן, על-ידי מעכבי סלקטיבית (למשל, AG1478)17 של קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), כרוך ראיות כי ההעברה של תאים הסמפונות המושרה על ידי פפטידים הנ ל ההפעלה של EGFR12, 18 הוא דיווח.

לסיכום, המטרה של נוהל זה היא להראות כיצד השימוש כזה מוסיף תרבות סיליקון מייצג של assay מהיר ונגיש בקלות כדי לקבוע במדויק נדידה של תאים חסיד (למשל, ברונכיט תאים אפיתל) ומולקולרית מנגנוני שליטה אירועים כאלה.

Protocol

1. תא הכנה זרע 2.5×106 תאים 10 מ”ל של מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מ גלוטמין (MEMg), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), אנטיביוטיקה (0.1 מ”ג/מ”ל של פניצילין, סטרפטומיצין) ו puromycin (0.5 µg/mL מבחר ותחזוקה של תא קו) בבקבוקון T75. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך יומיים. לפני תחילת הניסוי, ?…

Representative Results

פרוטוקול זה שימש כדי לקבוע את הפצע ריפוי אפקט Esc(1-21) ו- Esc(1-21) – 1 ג מבחינת פעילות ההעברה התאים המושרה בתאי אפיתל הסמפונות, המבטאת את CFTR פונקציונלי. ב הזה assay, תרבות מוסיף הונחו בבארות של צלחת 12-. ובכן, כל תא היה נזרע עם 35,000 בתאים MEMg בתוספת 10% FBS. התאים הגיעו למפגש מלא בתוך 24h. אחר כך…

Discussion

נדידת תאים הוא תהליך חיוני באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כולל ריפוי הפצע, התפתחות של סרטן גרורות. ההליך הבסיסי לימודים תא העברה במבחנה כרוך: (i) היצירה של חד שכבתי תא, (ii) הייצור של פצע מדומה בשכבה confluent של תאים, הסגר (iii) לכידת תמונות במרווחי זמן שונים עד הפציעה נגיש , ו- (ד) הניתוח ש?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ספיאנצה-אוניברסיטת רומא ועל קרן מחקר סיסטיק פיברוזיס איטלקי (פרוייקט טורבין #11/2014 שאומצה על ידי משלחות מועדון כדורגל מסיינה (siena), כולל Sondrio, Cerea Il Sorriso di ג’ני ו פאביה). חלק מעבודה זו נתמכה גם על-ידי FILAS FILAS פרוט גרנט-RU-2014-1020.

אנחנו אסירי תודה ד ר לורטה פררה (Genova מדיקה, Istituto ג’אנינה Gaslini, U.O.C. Genetica, איטליה) על מתן בתאי אפיתל הסמפונות.

Materials

Minimal essential medium (MEM)  Euroclone ECB2071L Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine Euroclone ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0180DH 
Penicillin and Streptomycin Euroclone ECB3001D
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS Euroclone ECB3052D Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) Sigma-Aldrich D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS) Sigma-Aldrich D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well Ibidi  80209
Wimasis Image Analysis Ibidi  30002
PRISM software  GraphPad version 6.0

Referencias

  1. Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
  2. Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
  3. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
  4. Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
  5. Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
  6. Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
  7. Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
  8. Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
  9. Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
  10. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
  11. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
  12. Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
  13. Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
  14. Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
  15. Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
  16. Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
  17. Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
  18. Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
  19. Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
  20. Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).

Play Video

Citar este artículo
Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. J. Vis. Exp. (133), e56825, doi:10.3791/56825 (2018).

View Video