Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el efecto de péptidos sobre la migración de células epiteliales bronquiales. Este método permite la obtención de datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre herida de migración celular rápida y altamente reproducible.
Abstract
El objetivo de este trabajo es mostrar un nuevo método para evaluar la capacidad de algunas moléculas inmunomoduladoras, como péptidos antimicrobianos (AMPs), para estimular la migración celular. Lo importante, migración celular es un evento de limitación de velocidad durante el proceso de cicatrización para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión. La ventaja de este método sobre el análisis clásico, que se basa en un rasguño hecho manualmente en una monocapa de células, es que el uso de la cultura de silicona especial inserta proporcionando dos compartimientos para crear un campo de pseudo-herido libre con un ancho bien definido (500 μm ). Además, debido a una plataforma de análisis de imagen automatizado, es posible obtener rápidamente datos cuantitativos sobre la velocidad de la herida cierre y migración celular. Más precisamente, se mostrará el efecto de dos amplificadores de piel de rana en la migración de células epiteliales bronquiales. Además, el tratamiento previo de estas células con inhibidores específicos proporcionará información sobre los mecanismos moleculares subyacentes a este tipo de eventos.
Introduction
En gran parte es conocido que la cicatrización de heridas en los animales es un proceso fundamental para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión1. A pesar de superficies epiteliales expuestas al medio externo (por ejemplo, la piel, vías respiratoria y tracto gastrointestinal) forman una barrera protectora de insultos físicos y químicos, la formación de heridas puede ocurrir fácilmente, especialmente después cirugía o infecciones microbianas2. Por ejemplo, la colonización del tejido pulmonar por el bacteriano patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa, sobre todo en enfermos de fibrosis quística (FQ), lleva a daño del epitelio de las vías aéreas con la consecuente insuficiencia respiratoria3, 4. La cicatrización es un mecanismo de reparación de host complejo para restaurar la arquitectura normal de un tejido lesionado5. Se caracteriza por la inflamación inicial, seguida de un período de regeneración abarca epithelialization, angiogénesis y remodelación tisular con la producción de colágeno y de la célula diferenciación6,7,8 . Para asegurar la integridad epitelial y para controlar la proliferación microbiana, todos los organismos vivos producen moléculas de defensa, incluyendo péptidos antimicrobianos (AMPs)9,10. El proceso de cicatrización es muy difícil simular en vitro debido a la falta de restos celulares y las interacciones complejas entre diferentes tipos de células. Sin embargo, la capacidad en vitro de un péptido para acelerar el cierre de una herida pseudo estimulando la migración de células epiteliales es indicativa de su capacidad para sanar un epitelio comprometido. De hecho, migración celular es un evento de limitación de velocidad en la cicatrización de heridas, y estudiar los factores que pueden afectar la migración celular ayudará a terapias objetivo para mejorar la cicatrización.
Aquí, un ensayo experimental altamente reproducible se proporciona basado en silicona especial cultura insertos para evaluar la migración de células in vitro. Se basa en la creación de un espacio μm 500 (pseudo-herida) sobre una monocapa celular confluente. Las células en el borde del campo artificial “herido” comenzará a migrar a la zona libre de células, formando nuevos contactos célula-célula. La inserción de la cultura representa una nueva herramienta para experimentos de cicatrización rápida. Se proporcionan dos depósitos separados por una pared μm 500, y pueden ser colocados correctamente en una placa de 3 cm plato o en el pozo de una placa de 12 pozos. Llena cada compartimiento del parte movible con una suspensión permite a las células crecer en cada área designada hasta confluencia, mientras que la extracción del inserto generará un espacio libre de células de aproximadamente 500 μm (el mismo ancho que el muro de separación). Un medio de cultivo celular adecuada complementado con un compuesto de prueba puede añadirse al plato placa/bien. Luego, el cierre de la brecha puede ser visualizado en diferentes intervalos de tiempo bajo un microscopio invertido, preferiblemente uno equipado con una cámara de vídeo para la adquisición de la imagen. Por último, medición de los cambios en el área de célula cubierta por el programa de análisis de imagen automatizado basado en web permite la cuantificación de la velocidad de la herida cierre y migración celular. En general, este método es un paso adelante en relación con el análisis clásico, donde un cero se hizo manualmente mediante la incisión de monocapas confluentes de células con una aguja estéril o pipeta tip11. De hecho, el último procedimiento puede destruir el plástico inferior del plato placa/pozo y el revestimiento de la superficie, creando arrugas. Además, el área de “herido” no tiene un ancho bien definido a lo largo de toda la longitud de la brecha, como esto depende altamente de la presión aplicada por los investigadores a la punta de aguja. Además, las células desalojadas pueden formar cúmulos de células vivas y muertas en los bordes del scratch; por otra parte, la propagación de las células vivas en el área de “herido” puede interferir con la velocidad de migración de la célula, generando resultados no reproducibles12.
Además, gracias a una plataforma de análisis de imagen cero, los usuarios pueden rápidamente recibir (en minutos) datos cuantitativos sobre el comportamiento migratorio de las celdas seleccionadas sin necesidad de adquirir software adicional. Esta plataforma es capaz de analizar imágenes de microscopía de contraste de fase de baja (~ 5 X), mediana (~ 10 X) y aumento alto (~ 20 X). Después de subir un archivo zip de imágenes (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, formato *.tiff) automáticamente se realizaron el análisis para generar un archivo de resumen que muestra el porcentaje de zonas cubiertas de células y zonas cero, así como la velocidad de la célula migración, a intervalos de tiempo distintos.
En este trabajo, mediante el uso de un amplificador-derivado de la piel de rana, es decir, Esc(1-21) y su diastereomer Esc(1-21) – 1 c13y una línea de células bronquiales expresando el funcional CF conductancia transmembrana (CFTR) del regulador14,15, se proporciona un ejemplo de la migración celular inducida por el péptido en comparación con las muestras sin tratamiento (control). Tenga en cuenta que el epitelio de las vías respiratorias y el CFTR desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la función pulmonar y16de la reparación de la herida. Además, mediante inhibidores selectivos (por ejemplo, AG1478)17 de receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE), evidencia que la migración de las células bronquiales inducida por los péptidos mencionados implica activación de EGFR12, 18 se divulga.
En Resumen, el objetivo de este procedimiento es mostrar cómo el uso de estos rellenos de silicona cultura representa un ensayo rápido y de fácil acceso para determinar con precisión la migración de células adherentes (p. ej., células epiteliales bronquiales) y molecular mecanismos que controlan este tipo de eventos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migración celular es un proceso esencial en muchos eventos fisiológicos y patológicos, incluyendo la cicatrización de heridas, desarrollo embrionario y metástasis del cáncer. El procedimiento básico para el estudio de la migración de la célula en vitro implica: (i) la creación de una monocapa de células, (ii) la producción de una pseudo-herida en la capa confluente de células, (iii) la captura de imágenes en diferentes intervalos de tiempo hasta que la herida cierre se alcanza y (iv) el análisis d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad la Sapienza de Roma y la Fundación italiana de investigación de Fibrosis Quística (proyecto FFC #11/2014 aprobada por delegaciones de FFC de Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny y Pavía). Parte de este trabajo fue apoyado también por FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Agradecemos al Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italia) para proporcionar a las células epiteliales bronquiales.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
Referencias
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
