Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

Es ist weitgehend bekannt, dass die Wundheilung bei Tieren ist ein fundamentaler Prozess die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung¹wieder herzustellen. Trotz epithelialen Oberflächen der äußeren Umgebung (z. B. der Atemwege, Haut und Magen-Darm-Trakte) bilden eine schützende Barriere von physikalischen und chemischen Beleidigungen, die Bildung von Wunden kann leicht auftreten, vor allem nach Chirurgie oder mikrobielle Infektionen². Wie beispielsweise Besiedlung des Lungengewebes durch opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas Aeruginosa, vor allem bei zystischer Fibrose (CF) erkrankten führt um zu Schädigungen der Atemwege Epithel mit daraus resultierenden Atemstillstand^{3, 4}. Wundheilung ist eine komplexe Host-Repair-Mechanismus zur Wiederherstellung der normalen Architektur von einem verletzten Gewebe⁵. Es zeichnet sich durch eine anfängliche Entzündung, gefolgt von einer Regenerierung umfasst Epithelisierung, Angiogenese und Gewebe Umbau mit Produktion von Kollagen und Zelle Differenzierung^6,7,8 . Epitheliale Integrität sicherzustellen und mikrobieller Vermehrung kontrollieren, produzieren alle lebenden Organismen Verteidigung Moleküle, einschließlich antimikrobielle Peptide (AMPs)^9,10. Die Wundheilung ist sehr schwierig, in-vitro- aufgrund des Fehlens von Zellenrückstand und komplexen Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen zu simulieren. Aber die in-vitro- Fähigkeit eines Peptids durch die Stimulierung die Schließung einer Pseudo-Wunde beschleunigen Migration von Epithelzellen ist bezeichnend für seine Fähigkeit zu heilen eine kompromittierte Epithel. In der Tat Zellwanderung ist eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Wundheilung, und Studium der Faktoren, die Zellwanderung beeinflussen können Ziel Therapien für eine verbesserte Wundheilung hilft.

Hierbei ist ein hoch reproduzierbarer experimentelle Assay vorgesehen, basierend auf Spezialsilikon Kultur Einsätze, Zelle Migration in Vitrozu bewerten. Es basiert auf der Schaffung einer 500 μm Lücke (Pseudo-Wunde) auf einer Monoschicht konfluierende Zelle. Die Zellen am Rand des Feldes künstliche “verletzten” startet in den zellfreien Bereich Migration, bilden neue Zell-Zell-Kontakte. Die Kultur einfügen stellt ein neues Tool für schnelle Wundheilung Experimente. Zwei Stauseen, die durch eine 500 μm Wand getrennt werden, und sie können richtig platziert werden, in einem 3 cm Schüssel Teller oder in den Brunnen von einem 12-Well-Platte. Jedes Fach des Einsatzes mit einer Zellsuspension füllen kann Zellen wachsen in jedem ausgewiesenen Bereich bis zum Zusammenfluss, während Entfernung des Einsatzes eine saubere zellfreie Lücke von etwa 500 μm (die gleiche Breite wie die Trennmauer) zu erzeugen. Eine ordnungsgemäße Zellkulturmedium, ergänzt mit einer Testverbindung können dann hinzugefügt werden, in die Schüssel Teller/gut. Danach kann der Lückenschluss in unterschiedlichen Zeitabständen unter einem inversen Mikroskop, vorzugsweise eine, die mit einer Videokamera ausgestattet, für die Bildaufnahme visualisiert werden. Schließlich ermöglicht die Messung von Veränderungen im Bereich Zelle abgedeckt durch die Web-basierte automatische Bild-Analyse-Programm die Quantifizierung der Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration. Insgesamt ist diese Methode ein Schritt nach vorn in Bezug auf die klassische Assay, wo ein Kratzer erfolgt manuell durch Eingrabung konfluierende Zelle Monolagen mit einer sterilen Nadel oder eine Pipette Tipp¹¹. In der Tat das letzte Verfahren zu zerstören die Kunststoff Boden der Schale Platte/gut und die Oberflächenbeschichtung, Falten zu schaffen. Darüber hinaus muss die “Verletzte” Bereich keine klar definierte Breite über die gesamte Länge der Lücke, da dies stark von den Forschern auf die Nadelspitze ausgeübte Druck abhängig. Darüber hinaus können die verdrängt Zellen an den Rändern des Kratzers Klumpen von lebenden und toten Zellen bilden; Darüber hinaus kann die Verbreitung von lebenden Zellen in den “verletzten” Bereich mit einer Geschwindigkeit von Zellwanderung, Generierung von nicht reproduzierbaren Ergebnisse¹²stören.

Darüber hinaus durch ein Rubbellos Bild-Analyse-Plattform erhalten schnell (innerhalb von Minuten) quantitative Daten über das Wanderungsverhalten der markierten Zellen ohne die Notwendigkeit, zusätzlichen Software zu erwerben Anwender. Diese Plattform ist geeignet zur Analyse von Kontrast Mikroskopie Phasenbilder niedrig (~ 5 X), Medium (~ 10 X) und hoch (~ 20 X) Vergrößerung. Nach dem Hochladen einer Zip-Datei von Bildern (in *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.GIF, *.tiff Format) wird automatisch die Analyse durchgeführt, um eine Übersichtsdatei zu generieren, die den Prozentsatz der Zelle bedeckten Gebiete und Kratzer Gebiete sowie die Geschwindigkeit der Zelle zeigt Migration, in unterschiedlichen Zeitabständen.

In dieser Arbeit mithilfe ein Frosch-Haut AMP-Derivat, d. h. Esc(1-21) und seine Diastereomer Esc(1-21) – 1 c-¹³und eine bronchiale Zell-Linie mit dem Ausdruck der funktionalen CF transmembranen Leitwert Regulator (CFTR)^14,15, ein Beispiel für Peptid-induzierte Zellwanderung im Vergleich zu unbehandelten (Kontrollproben) wird zur Verfügung gestellt. Beachten Sie, dass die Atemwege Epithel und CFTR eine entscheidende Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung der Lungenfunktion und Wunde Reparatur¹⁶. Darüber hinaus beinhaltet ein Beweis, dass die vorgenannten Peptide Migration bronchiale Zellen verursacht durch selektive Inhibitoren (z. B. AG1478)¹⁷ der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), Aktivierung des EGFR^{12, 18} berichtet.

Zusammenfassend lässt sich sagen soll das Ziel dieses Verfahrens zeigen, wie die Verwendung von solchen Silikon-Kultur-Einsätze stellt eine schnelle und leicht erreichbare-Assay, Migration von adhärenten Zellen (z. B. bronchialen Epithelzellen) und der molekularen genau zu bestimmen Mechanismen, die solche Ereignisse zu kontrollieren.