Techniques chirurgicales pour le Placement de cathéter et néphrectomie 5/6 dans les modèles murins de la dialyse péritonéale

Fonction rénale et la maladie rénale

Les reins sont des organes essentiels impliqués dans l’homéostasie, filtration du sang et la production d’hormones. Il y a différentes conditions qui conduisent à une insuffisance rénale et l’apparition subséquente d’urémie, qui a été défini comme le groupe de symptômes systémiques en raison de l’accumulation de déchets dans le sang conservé en raison de troubles rénaux fonction¹. En outre, capacité homéostatique est également affectée lorsqu’il y a une insuffisance rénale, l’hypertension artérielle due à une surcharge volumique susceptible de se produire, qui est aussi dangereuse car elle peut conduire à une insuffisance cardiaque¹. Lorsque la capacité fonctionnelle des reins est inférieure à 10 % - 15 %, le patient doit subir une des options thérapeutiques suivantes : hémodialyse, dialyse péritonéale (DP) ou la transplantation rénale.

PD est une option intéressante qui permet aux patients de continuer le traitement dans le confort de leur foyer ou pratiquement n’importe où, évitant ainsi la nécessité pour l’hôpital de fréquente visites et séjours. La technique de PD élimine les petites molécules toxiques et excès d’eau générée par le corps² par le biais de l’instillation d’un fluide osmotique (liquide de dialyse péritonéale, PDF) dans la cavité péritonéale. Cette instillation génère le gradient osmotique nécessaire pour l’échange d’eau entre le capillaire péritonéale et PDF, un processus appelé ultrafiltration (UF) et les solutés.

Péritonéale lésions induites par la dialyse péritonéale

La cavité péritonéale est recouvert d’une membrane (PM), composée d’une monocouche de cellules mésothéliales reposant sur une matrice, qui abrite aussi quelques vaisseaux sanguins, des fibroblastes, des macrophages et des autres populations de cellules. Malheureusement, la membrane péritonéale souffre toujours quelques altérations au cours du traitement de PD, tels que l’apoptose et la perte de cellules mésothéliales, transition mésenchymateuse mésothéliales (MMT) et les cellules endothéliales (fin-MT), recrutement des cellules inflammatoires et des fibrocytes, des altérations vasculaires, angiogenèse, lymphangiogenèse et/ou fibrose^{3,4,5,6,7,8,9}. Ces altérations sont responsables de l’élaboration d’un UF capacité échec¹⁰, qui s’oppose à la poursuite de la thérapie, qui exige que le patient doit recevoir un traitement alternatif pour survivre (hémodialyse ou transplantation rénale) . Par conséquent, pour ces patients, il est essentiel de retarder ou de contrôler le développement de ces altérations péritonéales.

Il a été spéculé que l’urémie seul peut causer une inflammation¹¹, mais le plus important facteur local est PDF bioincompatibility. La plupart des PDFs utilisent le glucose comme l’agent osmotique, ce qui provoque une inflammation. En raison de la durée de conservation PDF et la stérilisation, glucose subit un processus de dégradation, et apparaissent de nouveaux produits de cette réaction, générant plus d’inflammation, le TEM et apoptose^12,13. En outre, il y a aussi la possibilité de dommages mécaniques en raison de la méthode de l’instillation. Tous ces facteurs, agissant en permanence, peuvent générer un état inflammatoire persistant et récurrent, conduisant à une inflammation chronique, qui conduit à la détérioration de la membrane et, de façon concluante, échec de l’UF. Comment ce dommage pourrait être réduit ou évité est toujours un sujet d’étude.

Analyser le développement des lésions : des échantillons humains de modèles animaux

Travailler avec biopsies humaines est un facteur limitant en raison de la difficulté à obtenir des échantillons de tissus. Ces échantillons ne peuvent être obtenues de chirurgies effectuées en raison de dysfonctionnement du cathéter ou de la transplantation, généralement après des années de traitement PD. Cette approche est utile pour l’analyse des changements pathologiques subi par une membrane péritonéale exposée au format PDF, mais il n’est pas suffisante pour étudier le développement du processus. Une autre possibilité consiste à analyser les cellules drainées dans les effluents de la dialyse, mais cela ne fonctionne toujours pas fournir un scénario complet. La fusion de ces deux techniques n’est possible avec des modèles animaux. La structure péritonéale est similaire chez les mammifères, et donc il y a des modèles avec différentes espèces animales. Il existe quelques études issus des moutons (Rodela et al. ¹⁴ et Barrell et al. ¹⁵) et lapin^16,17 modèles ; Toutefois, de petits animaux sont préférables car elles sont plus faciles à la maison et maintiennent et sont également plus économiques. L’utilisation de rats^{18,19,20,21,22,23,24} offre un temps de traitement plus court pour observer altérations Morpho-fonctionnelles. Il a représenté un modèle très utile pour étudier différentes questions telles que l’effet des médicaments anti-fibrosants comme, par exemple BMP-7 (morphogénique osseuse protéine-7)²⁵ et RAS (système rénine-angiotensine) ciblant^{26,27 , 28}.

Toutefois, le modèle murin est devenue un modèle idéal avec nombreux avantages sur les autres. L’avantage des plus intéressante est la possibilité d’utiliser des organismes génétiquement modifiés de souris pour étudier la base moléculaire et cellulaire des dommages péritonéale. En fait, les souris sont souvent employés pour l’analyse de nombreuses maladies, comme il existe de nombreuses souches différentes avec différents fonds génétiques connues. D’autres avantages incluent le réduit l’espace requis pour le logement, réduit le coût des expériences (en raison de la petite taille de l’animal), facilité de manipulation, la disponibilité des réactifs et le nombre croissant d’informations disponibles sur les différentes souches de souris depuis qu’ils ont été plus couramment utilisé des animaux en recherche.

Un modèle de souris qui emploient un implant a été le modèle le plus récemment créé pour PD^29,30et a été montré pour imiter péritonéale détérioration subie par les patients Parkinsoniens dus à l’exposition au format PDF. Ce modèle a collaboré pour comprendre que les processus pathologiques impliqués^31,32,,³³. En outre, il a été utilisé pour valider les différents traitements possibles pour améliorer cette détérioration à l’aide de modulateurs immunitaires et anti-inflammatoires non stéroïdiens et autres anti-fibrosants et agents anti-angiogéniques, tels que les inhibiteurs de COX-2 (cyclo-oxygénase-2) ³⁴, agonistes de PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ)³⁵, tamoxifène³⁶, Paricalcitol (un activateur du récepteur vitamine D qui module la réaction immunitaire)³⁷,³⁸ de la rapamycine et Nebivolol ³⁹.

Élaboration d’un modèle souris avec un cathéter implanté

Ce modèle vise à ressembler, autant que possible, la technique utilisée chez des patients humains de PD, permettant d’effectuer des traitements prolongées de PD chez de petits animaux. Jusqu’ici, trois techniques pour l’instillation du liquide de dialyse dans le péritoine ont été testées chez des souris. L’une, aveugle perforation du front de la paroi abdominale, est controversé en raison des risques multiples qu’il peut encourir, tels que les dommages péritonéal, saignements et, comme c’est une ponction réalisée aveuglément, viscérale. La deuxième technique est le soi-disant « permanent système ouvert », dans lequel le dispositif d’injection du fluide est placé en dehors du corps. Cette procédure est plus similaire à celui effectué chez l’humain. Toutefois, il ne permet pas le développement d’expériences à long terme, car elle peut augmenter les risques d’infection et requiert généralement l’utilisation de l’anesthésie à instiller PDF, qui peut interférer avec les résultats. La troisième technique est le « système fermé ». Avec cette approche, l’ensemble du dispositif utilisé pour l’instillation fluide est situé à l’intérieur du corps de l’animal. Le liquide est injecté avec une aiguille dans un port d’accès, qui est placé sous la peau. Cette procédure réduit le risque d’infection péritonéale et saignements ainsi que la nécessité d’une anesthésie.

Pour étudier l’effet de l’urémie dans PD, un modèle murin récent a également été établi⁴⁰ basé sur le modèle de perfusion de PDF avec le cathéter. Ce modèle apporte une nouvelle technique pour effectuer une néphrectomie chez la souris, ce qui réduit la fonction rénale. Dans le présent article, une modification du protocole employé par Ferrantelli et coll. en 2015⁴⁰ a été développée. Ce nouveau protocole permet l’implantation du cathéter en une néphrectomie, réduit la durée de la blessure infligée au cours de la chirurgie et facilite l’accès aux reins.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’utilisation de la biologie moléculaire Centre Severo Ochoa (Madrid, Espagne) et d’institutionnels animalier.

Remarque : Les souris C57BL/6J femelles âgés de 12 à 14 semaines et pesant environ 20 g au début de l’étude ont été utilisées. Tous les animaux étaient logés dans des conditions normales et ont reçu de nourriture et eau ad libitum. Conditions de police sanitaire ont été vérifiées quotidiennement. Le matériel requis, tels que gants, drapé, cathéter, suture et aiguilles, devrait être stérile.

1. Placer le cathéter

Remarque : Si les reins ne sont pas éliminés, ils restent complètement fonctionnels, donc il ne considère pas l’effet de l’urémie, permettant ainsi l’étude de l’exposition PDF en vase clos. La chirurgie consiste en présentant seulement l’extrémité distale du cathéter dans la cavité péritonéale et placer le port d’accès à l’arrière de l’animal, donnant accès à elle. La procédure de placer le cathéter est comme suit :

1. Placez la souris dans une chambre à induction et fournir l’anesthésie à l’aide de 4 % isoflurane et oxygène avec un débit de 0,4 L/min jusqu'à ce que la perte du réflexe de redressement.
   1. Maintenir l’animal à l’isoflurane de 2 % à 100 % d’oxygène avec un débit de 0,3 L/min au moyen d’un tube de nez conique relié à l’appareil d’anesthésie. Confirmer anesthetization appropriée en évaluant le tonus musculaire et la réponse à la stimulation.
   2. Vérifier le taux et la profondeur de la respiration durant tout le processus. La pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie. Il est préférable que les procédures sont effectuées dans une enceinte à flux pour assurer le maintien de conditions stériles lors de chirurgies.
2. Raser le flanc droit et le dos des animaux afin d’effectuer la chirurgie et plus tard d’injecter le liquide à l’orifice d’accès dans un endroit propre. Placer l’animal dans une position latérale reposant sur son flanc gauche dans la table d’opération chirurgicale, avec un système thermique pour s’assurer que sa température ne descend pas.
3. Désinfecter la zone avec une solution de gluconate de chlorhexidine 1 %. Faire une petite incision (0,5 cm) avec des ciseaux émoussé dans la peau sur le flanc droit du corps et de le séparer soigneusement avec l’aide des ciseaux de la couche de muscles adjacents afin que toute la zone du dos de l’animal est bien séparée pour plus tard pouvoir introduire le port d’accès en toute simplicité. S’il vous plaît faire référence à la Figure 1 pour voir les matériaux nécessaires pour suivre la procédure.
4. Faire une petite incision d’environ 1 mm de diamètre à travers la couche de muscle et insérer l’extrémité du cathéter et le premier anneau en plastique. Les dégâts péritonéale sont minime.
5. Suture de la paroi péritonéale serré autour de la sonde, avec une suture non résorbable 5.0 ou 6.0. Un anneau en plastique est alors situé à l’intérieur de la cavité péritonéale et l’autre entre le muscle et la peau. Le cathéter est ainsi fixé pour empêcher le fluide de couler dans l’espace sous-cutané.
6. Insérer le port d’accès dans l’espace sous-cutané vers la queue de la souris, sans la fixer à une position fixe sur la peau, car il peut provoquer des démangeaisons et les animaux peuvent rayer et peu leur peau.
7. Refermer la plaie de la peau avec une suture non résorbable 5.0 ou 6.0. Retirer l’anesthésie par inhalation et laisser l’animal à reprendre conscience. N’abandonnez pas la souris jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Lorsque complètement rétabli, les souris peuvent être retournée à la compagnie d’autres animaux.
   Remarque : Les expériences peuvent commencer après 4 à 7 jours de récupération post-opératoire.
8. Fournir une analgésie en dissolvant 3 mL d’ibuprofène (20 mg/mL) dans 250 mL d’eau potable pour la journée de la chirurgie.
9. Au cours de la période postopératoire, vérifier l’état de santé de l’animal tous les jours, vérifier qu’il n’y a pas de zones rougies sur la peau, les cheveux hérissés ou les blessures.
10. Injecter le liquide en tenant l’animal (sans anesthésier il) par la queue et en saisissant le port d’accès avec une seule main et l’aiguille avec l’autre. Désinfecter la zone avec la solution de gluconate de chlorhexidine 1 % avant l’injection. Il est intéressant d’utiliser des aiguilles spéciales (aiguilles de Huber), qui sont biseautés pour partie au lieu de pierce le septum en silicone de la cœlio (Figure 1 a). Deux injections par jour pendant 40 jours suffisent pour observer des altérations péritonéales (Figure 3).
11. Lors de la finition de l’expérience, euthanasier la souris par asphyxie de dioxyde de carbone ou de dislocation cervicale.

2. effectuer une néphrectomie 5/6 et placer le cathéter

Remarque : Il est possible de réaliser une néphrectomie 5/6, qui permet uniquement une fonction rénale résiduelle pour mieux ressembler à la situation dans les patients Parkinsoniens. Il faut dans ce cas, les échantillons de sérum pour analyser l’urée niveaux en extrayant 250 μL de sang par la veine faciale perforer, au moins une journée avant de commencer les interventions chirurgicales, au milieu du traitement et quand sacrifier les animaux. Il est préférable que les procédures sont effectuées dans une enceinte à flux pour assurer le maintien de conditions stériles lors de chirurgies.

1. Anesthésier les souris par l’isoflurane comme étape 1.1.
2. Fournir une analgésie avec 0,1 mg/kg de buprénorphine, injectée par voie sous-cutanée au niveau du cou de l’animal et en dissolvant 3 ml d’ibuprofène (20mg/ml) dans 250 ml d’eau potable pour la veille et le jour de la chirurgie.
3. Rasez les latéraux et le dos des animaux afin d’effectuer les interventions chirurgicales et plus tard d’injecter le liquide à l’orifice d’accès dans un endroit propre.
4. Effectuer une incision d’environ 0,5 cm de la peau, sur le côté gauche, à proximité des côtes, d’avoir un accès direct au rein gauche.
5. Ouvrez une petite incision dans le muscle de prendre le rein gauche hors du péritoine, enlever la capsule et la glande surrénale. Pour enlever la capsule est nécessaire pour mieux contenir le rein en dehors de la cavité péritonéale.
6. Graver et couper les extrémités du rein avec un cauterizer (voir la Figure 1 pour les matériaux nécessaires).
7. Réintroduire le rein dans la cavité péritonéale et suturer les blessures à la peau et le muscle avec insoluble suture 5.0 ou 6.0.
8. Le lendemain, complètement enlever le rein droit et insérer le cathéter en utilisant la même incision quant à enlever le rein. Encore une fois, anesthésier la souris à l’isoflurane et injecter par voie sous-cutanée de 0,1 mg/kg de buprénorphine juste avant l’intervention chirurgicale. Aussi dissoudre 3 ml d’ibuprofène (20mg/ml) dans 250 ml d’eau potable la veille et le jour de la chirurgie.
9. Faire une incision dans la peau d’environ 0,5 cm et avec l’aide des ciseaux, détacher la peau à l’arrière de l’animal dans le muscle d’ouvrir l’espace où se situera le port d’accès.
10. Effectuer une coupe dans le muscle (de 0,3 à 0,4 cm) de prendre le rein droit hors de la cavité péritonéale.
11. Retirer la capsule et la glande surrénale à avoir un meilleur accès pour les reins. Ligaturer la veine rénale, l’artère et l’uretère avec suture non résorbable, 5.0 ou 6.0 et enlever le rein complètement.
12. Suture de la plaie à le muscle péritonéale, introduction de l’extrémité du cathéter afin que le muscle doit rester entre les deux anneaux en plastique, comme expliqué précédemment (étape 1.5).
13. Introduire le port d’accès dans l’espace sous-cutané et suture de la peau comme indiqué dans les étapes 1.6 et 1.7.
    Remarque : Souris devraient reposer pendant au moins 10 jours de ces chirurgies pour s’assurer que les blessures au muscle péritonéal sont complètement guéries et il n’y aura aucun fuite dans l’espace sous-cutané s’injecter le liquide. Injecter le liquide comme au point 1.10.
14. Lors de la finition de l’expérience, euthanasier les animaux par asphyxie de dioxyde de carbone ou de dislocation cervicale.

La figure 1 montre tout le matériel nécessaire pour suivre les procédures décrites dans la section protocole. Pour cet exemple, les souris soumises ou non à une néphrectomie (8 animaux par groupe) (Figure 2) ont été exposés pendant 40 jours (deux injections par jour, attendre au moins 2 heures entre les deux) à un mélange de deux différents au format PDF, couramment utilisés dans la pratique clinique : EXTRANEAL (icodextrine basé sur PDF) et Dianeal (PDF base de glucose). Un groupe avec une solution saline a été établi en tant que contrôle (n = 6).

Tissus péritonéales pariétales de souris ont été extraites de la zone plus éloignée du cathéter. Des échantillons ont été analysés afin de comparer l’épaississement de la membrane, ainsi que la présence de cellules et la couche mésothéliales préservation (Figure 3). À cet égard, épaisseur et la présence de cellules sont a augmenté au cours de la dialyse et aggravées dans le groupe néphrectomisé. Cellules mésothéliales montrent aussi une morphologie altérée puisque syndicats intercellulaires subissent au cours de la PD.

Échantillons de sérum ont été prélevés néphrectomisés souris pour analyser les niveaux de l’urée en extrayant des 250-400 µL de sang par ponction de la veine faciale, à trois moments différents : un jour avant les interventions chirurgicales, milieu du traitement et point final. Dans le cas d’aucune souris néphrectomisés, échantillons de sérum ont été seulement obtenus au point final (Figure 4). Des mesures ont été effectuées à l’aide d’un système intégré de chimie (voir Table des matières). Les résultats montrent que néphrectomie 5/6 induit un État urémique, augmentation des niveaux d’azote uréique au cours de l’expérience en comparant avec l’état initial. En outre, lorsque les reins sont entièrement fonctionnels, azote uréique niveaux restent similaires à l’état basal, même chez les souris exposées au format PDF (Figure 4).

Figure 1 . Matériel requis pour les chirurgies de la suivie et l’implantation de cathéter. (A) cathéter et suture non résorbable aiguille 6.0 (B), en acier inoxydable point émoussé pincettes, verrouillage clamp pince (pour maintenir l’aiguille) et émoussé écouvillons de ciseaux, de cauterizer et de coton. Matériel doit être stérilisé avant chirurgies. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 . Photos de la ligature du rein droit et le rein gauche extrêmes enlèvement par combustion avec le cauterizer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 . Coloration Trichrome de Masson. Photos représentatives (400 X) des membranes péritonéale de souris exposées à PDFs + 5/6 néphrectomie, un fichier PDF (sans néphrectomie) et une solution saline (sans néphrectomie). Les flèches montrent l’augmentation de la cellularité et perte d’intégrité de la couche mésothéliales. Lignes noires montrent l’épaisseur de la membrane péritonéale, où la coloration bleue correspond à la matrice extracellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 . Taux d’azote uréique sériques (mg/dL) de souris exposées aux solutions PDF, soumises ou non à la procédure de la néphrectomie et souris traitées avec une solution saline seule. Données sont représentées sous moyenne et écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les premières données publiées analysant les altérations PD en utilisant une technique de « fermer le système » a été réalisées en 2009,²⁹ . Ce système étroit signifie que l’ensemble du dispositif est situé à l’intérieur du corps et le liquide est injecté avec une aiguille dans un port d’accès. Le plus important problème technique dans des modèles animaux à long terme de perfusion fluide au moyen d’une sonde est la présence d’obstruction. Les options possibles sont à effectuer omentectomie ou ajouter l’héparine pour les fichiers PDF afin de réduire les adhérences péritonéales. Néanmoins, l’épiploon agit comme un organe de défense et l’héparine, outre ses effets anticoagulants, module de processus tels que l’activité des cellules inflammatoires, l’angiogenèse, la synthèse de la matrice extracellulaire et la prolifération des cellules. La conception de l’appareil original publié en 2009 a été plus tard améliorée pour résoudre ces problèmes, réduisant la taille de l’orifice d’accès et d’ajuster le diamètre de la sonde afin de faciliter la sortie du liquide.

Modèles animaux sont essentiels pour l’analyse de l’évolution de nombreuses maladies, ainsi que l’efficacité de faisabilité et le potentiel des mesures prises sur les voies impliquées dans les maladies. Le modèle de souris de perfusion fluide péritonéal peut être utile pour étudier un large éventail de pathologies, ainsi que pour développer des traitements médicamenteux. Ce modèle offre un excellent outil pour l’instillation à long terme de médicaments ; Nous attendons donc, qu'il peut contribuer à améliorer la qualité de vie des patients souffrant de diverses maladies.

Il y a deux questions qui doivent être prises en compte pour ces expériences. Le premier est le fait que le fluide est administré dans l’abdomen mais pas supprimé comme dans les patients Parkinsoniens. Tout d’abord, il est important de noter que ce sont des modèles de PD-exposition, où le but est d’étudier les effets du fluide sur le péritoine, ne pas à enlever l’eau et métabolites. Néanmoins, pour les études de PD chez les souris, il est inutile pour l’enlèvement de fluide chaque fois, car il peut être éliminé avec l’urine. En fait, nous avons observé que 5/6 souris néphrectomisés ne deviennent pas oedémateux, parce que la fraction de rein qui reste est encore fonctionnelle et le temps que nous laisser entre les injections quotidiennes est suffisant pour uriner le volume administré. En outre, l’extraction du fluide se traduira par anesthésier l’animal tous les jours et l’ouverture de la cavité péritonéale à l’égout, avec des lésions tissulaires ultérieures. Une autre option consisterait à extraire le liquide à travers le cathéter, mais il s’effondrerait car elle va sucer les organes. Une troisième option a été récemment publié⁴¹, mais ce n’est pas adapté pour les traitements longs.

Le deuxième problème est que les cathéters à demeure peuvent provoquer une réaction de corps étrangers qui pourrait interférer avec les résultats^42,43. Par conséquent, cet effet a été étudié dans la membrane péritonéale chez des souris exposées uniquement à la présence du cathéter. Les résultats ont montré qu’il existe un épaississement du péritoine et l’accumulation de nouvelles cellules sur le site d’insertion. Cependant, cette réaction diminue progressivement dans les zones éloignées du point d’insertion de cathéter. La membrane péritonéale du côté du péritoine en face de la sonde a la même apparence que la membrane d’une souris de contrôle naïf (données non présentées). Pour cette raison, il est important d’analyser le côté gauche de la paroi péritonéale lorsque vous cherchez des altérations morphologiques, évitant également le linea alba.

L’utilisation d’un cathéter à demeure évite la nécessité pour les ponctions répétées dans le péritoine pendant la durée du traitement, ce qui réduit le risque d’infection, hémopéritoine et la possibilité de nuire à un organe. En outre, cette technique ressemble plus étroitement à la procédure d’instillation PDF chez des patients humains. Lorsque le liquide est à doser, l’animal reste complètement éveillé. La zone sélectionnée de la peau est nettoyée et que le port d’accès est tenu. Il est donc inutile de tenir l’animal, qui peut lui causer un stress excessif et élimine la nécessité pour l’anesthésie, qui peut interférer avec les résultats.

Le protocole pour le suivie d’abord publié par Ferrantelli et reception en 2015⁴⁰ a été modifiée afin de réduire de plaie pour la chirurgie et en profitant de l’incision nécessaire pour l’extraction du rein droit à introduire le cathéter.