Kirurgiske teknikker til kateter placering og 5/6 nephrectomistatus i Murine modeller af peritonealdialyse

Nyrefunktion og nyresygdom

Nyrerne er væsentlige organer involveret i homøostase, blod filtrering og hormonproduktion. Der er forskellige betingelser, der fører til nyresvigt og den efterfølgende udbrud af Uræmi, som er blevet defineret som gruppe af systemiske symptomer på grund af ophobning af affaldsstoffer i blodet bevaret på grund af nyre funktion lidelser¹. Desuden, da homeostatiske evne påvirkes også, når der er en nyresvigt, hypertension skyldes volumen overbelastning kan forekomme, hvilket er også farligt, da det kan føre til hjertesvigt¹. Når den funktionelle kapacitet af nyrerne er mindre end 10% - 15%, patienten skal gennemgå en af de følgende terapeutiske muligheder: hæmodialyse, peritonealdialyse (PD) eller renal transplantation.

PD er en interessant mulighed, der gør det muligt for patienter at fortsætte behandling fra komfort i deres hjem eller næsten hvor som helst, så man undgår behovet for hyppige hospital besøg og ophold. PD teknik eliminerer mindre giftige molekyler og overskydende vand genereret af kroppen² gennem instillation af en osmotisk væske (peritonealdialyse væske, PDF) ind i bughulen. Denne instillation frembringer den osmotiske gradient nødvendige for udveksling af opløste stoffer og vand mellem peritoneal kapillær og PDF, en proces kendt som ultrafiltrering (UF).

Peritoneal skade induceret af peritonealdialyse

Bughulen er dækket af en membran (PM), der består af en éncellelag af mesothelial celler hvilende på en matrix, som også huser få blodkar, fibroblaster, makrofager og andre cellepopulationer. Desværre, den peritoneale membran altid lider nogle ændringer under PD behandling, såsom apoptose og tab af mesothelial celler, mesenkymale overgang af mesothelial (MMT) og endotelceller (slutningen-MT) celler, rekruttering af inflammatoriske celler og fibrocytes, vaskulære ændringer, angiogenese, lymphangiogenesis og/eller fibrose^{3,4,5,6,7,8,9}. Disse ændringer er ansvarlig for udviklingen af en UF kapacitet fiasko¹⁰, som er til hinder for en fortsættelse af den behandling, der kræver, at patienten skal modtage en alternativ behandling for at overleve (hæmodialyse eller renal transplantation) . For disse patienter, er det derfor vigtigt at forsinke eller kontrollere udviklingen af disse peritoneal ændringer.

Det er blevet spekuleret, at Uræmi alene kan forårsage betændelse¹¹, men den vigtigste lokale faktor er PDF-bioincompatibility. De fleste PDF'er bruge glukose som den osmotiske agent, der forårsager betændelse. PDF opbevaring gange og sterilisation, glucose lider en proces med nedbrydning og nye produkter fra denne reaktion vises, generere mere betændelse, MMT og apoptose^12,13. Derudover er der også mulighed for mekaniske skader på grund af metoden instillation. Alle disse faktorer, fungerer kontinuerligt, kan generere en vedvarende og tilbagevendende inflammatorisk tilstand, fører til kronisk betændelse, som drev membran forringelse og endegyldigt, UF fiasko. Hvordan denne skade kunne reduceres eller undgås er stadig et spørgsmål om undersøgelsen.

Analysere udviklingen af læsioner: fra menneskelige prøver at dyremodeller

Arbejde med menneskelige biopsier er en begrænsende faktor på grund af vanskeligheden ved at få vævsprøver. Disse prøver kan kun fås fra operationer udføres på grund af kateter funktionsfejl eller transplantation, normalt efter års PD behandling. Denne tilgang er nyttigt til analyse af patologiske forandringer påført en peritoneale membran udsat for PDF, men er ikke tilstrækkeligt at studere udviklingen af processen. En anden mulighed er at analysere celler drænet fra dialyse spildevand, men dette stadig lykkes ikke at give en komplet scenario. Sammenlægning begge teknikker er kun muligt med dyremodeller. Peritoneal strukturen er den samme blandt pattedyr, og derfor er der modeller med forskellige dyrearter. Der er et par undersøgelser baseret på får (Rodela et al. ¹⁴ og Barrell et al. ¹⁵) og kanin^16,17 modeller; mindre dyr er dog at foretrække, da de er nemmere at house og vedligeholde, og er også mere økonomisk. Brugen af rotter^{18,19,20,21,22,23,24} tilbyder en kortere behandling tid til at observere morfo-funktionelle ændringer. Det har repræsenteret en meget nyttig model til at udforske forskellige emner som effekten af anti-fibrotisk narkotika som for eksempel BMP-7 (knogle morphogenic protein-7)²⁵ og RAS (renin-angiotensin systemet) rettet mod^{26,27 , 28}.

Dog, modellens murine fremstod som en ideel model med mange fordele frem for andre. Den mest interessante fordel er muligheden af at anvende genetisk modificerede mus for at studere molekylære og cellulære grundlag for peritoneal skader. I virkeligheden, er mus ofte ansat til analyse af talrige sygdomme, som der er mange forskellige stammer med forskellige kendte genetiske baggrunde. Andre fordele omfatter det reducerede pladsbehov for boliger, reducerede omkostninger for eksperimenter (på grund af dyrenes mindre størrelse), nem håndtering, tilgængeligheden af reagenser og den stigende mængde af tilgængelige oplysninger om de forskellige stammer af mus da de har været mest almindeligt anvendte dyr i forskning.

En mus-baseret model beskæftiger en indopereret enhed har været den mest for nylig etablerede model for PD^29,30, og har vist sig at efterligne peritoneal forringelse påført PD patienter på grund af eksponering på PDF-filer. Denne model har samarbejdet for at forstå de patologiske processer impliceret^31,32,33. Desuden, det har været brugt til at validere forskellige mulige behandlinger for mildne denne forringelse ved hjælp af immunmodulatorer og anti-inflammatoriske lægemidler og andre anti-fibrotisk og anti-angiogene agenser, såsom COX-2 (cyclooxygenase-2) hæmmere ³⁴, PPAR-γ (Peroxisom proliferator-aktiveret receptor-γ) agonister³⁵, Tamoxifen³⁶, Paricalcitol (en vitamin D receptor aktivator der modulerer en immunreaktion)³⁷, Rapamycin³⁸ og Nebivolol ³⁹.

Udvikle musemodel med en indopereret kateter

Målet med denne model er at ligne, så meget som muligt, teknikken bruges i menneskelige PD patienter, gør det muligt for at udføre udvidede behandlinger af PD i små dyr. Hidtil har er tre teknikker for instillation af dialyse væske ind i bughinden blevet testet i mus. Den første en blind punktere af forreste bugvæggen, er kontroversielle på grund af flere risici, som det kan pådrage sig, såsom peritoneal skader, blødning, og som er blindt udføres, visceral punktering. Den anden teknik er det såkaldte "åbne permanent system", hvor enheden for intravenøs væske er placeret uden for kroppen. Denne fremgangsmåde er mest ligner, udføres i mennesker. Men det tillader ikke udvikling af langsigtet eksperimenter, da det kan øge risikoen for infektion, og generelt kræver brugen af anæstesi til instill PDF, som kan interferere med resultaterne. Den tredje teknik er "lukket system". Med denne tilgang ligger hele enheden bruges til væske instillation inde i dyrets krop. Væske sprøjtes med en nål gennem et adgangsport, som er placeret subkutant. Denne fremgangsmåde reducerer risikoen for peritoneal infektion og blødning samt behovet for anæstesi.

For at undersøge effekten af Uræmi i PD, en nylig murine model har også været blev oprettet⁴⁰ baseret på modellens PDF infusion med kateter. Denne model bringer i en ny teknik til at udføre en nephrectomistatus i mus, dermed reducere nyrefunktionen. I denne artikel, er blevet udviklet en ændring af den protokol, der er ansat af Ferrantelli et al. i 2015⁴⁰ . Denne nye protokol giver kateter implantation mens nephrectomistatus, reducerer længden af sår påført under operationen og letter adgangen til nyrerne.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Molekylærbiologi Center Severo Ochoa (Madrid, Spanien).

Bemærk: C57BL/6J hunmus alderen 12 til 14 uger og vejer ca 20 g ved starten af undersøgelsen blev brugt. Alle dyr har været opstaldet under standardbetingelser og fik mad og vand ad libitum. Sundhedsmæssige betingelser var kontrolleres dagligt. Det materiale, der kræves, såsom handsker, drapere, kateter, sutur og nåle, bør være sterile.

1. placere kateteret

Bemærk: Hvis nyrerne ikke er fjernet, de forbliver helt funktionelle, så den ikke tager effekten af Uræmi, således tillader undersøgelse af PDF eksponering i isolation. Operationen består på at indføre kun den distale ekstreme af kateteret ind i bughulen og placere adgangsport på bagsiden af dyret, giver adgang til den. Proceduren skal placeres kateteret er som følger:

1. Placere musen i en induktion kammer og give anæstesi ved hjælp af 4% isofluran og ilt med en gennemstrømningshastighed på 0,4 L/min. indtil tab af oprettende refleks.
   1. Vedligeholde dyr med 2% isofluran i 100% ilt med en strøm af 0,3 L/min ved hjælp af et nosecone rør tilsluttet apparatet anæstesi. Bekræfte korrekt anesthetization ved at vurdere muskuløs tone og respons på stimulation.
   2. Check den sats og dybde af respiration i løbet af processen. Bruge vet salve på øjne til at forhindre tørhed under anæstesi. Det er at foretrække, hvis procedurerne udføres i et flow kabinet at sikre vedligeholdelse i sterile forhold under operationer.
2. Barbere højre flanke og bagsiden af dyrene, for at udføre kirurgi og senere injicere væske på havnens adgang i et rent område. Placere dyret i en lateral position hvile på sin venstre flanke i tabellen kirurgisk med en termisk system til at sikre, at dets temperatur ikke vil falde.
3. Desinficere området med 1% klorhexidin gluconat løsning. Gør et lille snit (0,5 cm) med en sløv saks i huden på den højre flanke af kroppen, og adskille det omhyggeligt ved hjælp af saks fra det tilstødende muskel lag, således at hele området af bagsiden af dyret er godt adskilt for senere at kunne indføre porten på access med lethed. Venligst reference figur 1 for at se materialerne skal følge proceduren.
4. Gør et lille snit på ca. 1 mm i diameter gennem laget muskel og Indsæt spidsen af kateteret og den første plastik ring. Peritoneal skaden er minimal.
5. Sutur peritoneal væggen stramt omkring kateteret, med en 5.0 eller 6.0 ikke-resorberbare sutur. En plastik ring er derefter placeret inde i bughulen, og den anden mellem muskel og huden. Kateteret er dermed fast at forhindre, at væske siver ud i det subkutane rum.
6. Indsæt adgangsport i det subkutane rum mod halen af musen, uden at sikre det til en rettelse position på huden, da det kunne klø og dyrene kan ridse og lidt deres hud.
7. Lukke såret i huden med en 5.0 eller 6.0 ikke-resorberbare sutur. Fjerne inhalation anæstesi og give dyret til at inddrive bevidsthed. Efterlad ikke musen uden opsyn indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Når fuldt tilbagebetalt, kan musen returneres til selskab med andre dyr.
   Bemærk: Eksperimenter kan påbegyndes efter 4 til 7 dage af postoperativ nyttiggørelse.
8. Give analgesi ved at opløse 3 mL af ibuprofen (20 mg/mL) i 250 mL af drikkevand til dagen for operationen.
9. Kontrollere de sundhedsmæssige status af dyret dagligt, kontrollere, at der er ingen røde områder på huden, strittende hår eller sår den postoperative periode.
10. Injicere væske ved at holde dyret (uden at bedøve det) i halen og sensationsprægede adgangsport med den ene hånd, og nålen med den anden. Desinficere området med 1% klorhexidin gluconat løsning før injektion. Det er interessant at bruge særlige nåle (Huber nåle), der er skrå for at del i stedet for pierce silikone septum af adgangsport (figur 1A). To injektioner om dagen i 40 dage er nok til at observere peritoneal ændringer (figur 3).
11. Når efterbehandling eksperimentet, aflive mus af kuldioxid kvælning eller livmoderhalskræft dislokation.

2. udføre en 5/6 nephrectomistatus og placere kateteret

Bemærk: For at bedre ligner situationen i PD patienter er det muligt at udføre en 5/6 nephrectomistatus, så kun en resterende nyrefunktionen. I dette tilfælde tages serumprøver til at analysere urinstof niveauer ved at udtrække 250 μL blod via ansigtet vene punktere, mindst én dag før du starter operationer på midten af behandlingen og når at ofre dyr. Det er at foretrække, hvis procedurerne udføres i et flow kabinet at sikre vedligeholdelse i sterile forhold under operationer.

1. Bedøver mus ved hjælp af isofluran som i trin 1.1.
2. Give analgesi 0,1 mg/kg af buprenorphin, injiceres subkutant på nakken af dyret og ved at opløse 3 ml af ibuprofen (20mg/ml) i 250 ml af drikkevand til dagen før og dagen for operationen.
3. Barbere laterals og bagsiden af dyrene, for at udføre operationer og senere injicere væske på havnens adgang i et rent område.
4. Udføre et snit på ca 0,5 cm i huden, på venstre side, tæt på ribbenene, skal have direkte adgang til venstre nyre.
5. Åbne et lille snit i musklen til at tage den venstre nyre ud af bughinden, fjernelse af kapslen og binyrerne. Hvis du vil fjerne kapslen er nødvendigt at bedre holde nyrerne uden for bughulen.
6. Brænde og skære ekstremer af nyrerne med et cauterizer (Se figur 1 for nødvendige materialer).
7. Genindføre nyrerne i bughulen og sutur sår på musklen og huden med uopløselige 5.0 eller 6.0 sutur.
8. Dagen efter, helt fjerne den højre nyre og indsætte kateteret bruger de samme indsnit at fjerne nyrerne. Igen, bedøver mus med isofluran og subkutant injicere 0,1 mg/kg af buprenorphin lige før den kirurgiske procedure. Også opløse 3 ml af ibuprofen (20mg/ml) i 250 ml af drikkevandet dagen før og dagen for operationen.
9. Gøre et snit i huden på ca. 0,5 cm, og med hjælp af saks, adskille huden på bagsiden af dyret fra musklen til at åbne det rum, hvor havnens adgang vil blive placeret.
10. Udføre en klip i musklen (om 0,3-0,4 cm) til at tage den højre nyre ud af bughulen.
11. Fjerne kapslen og binyrerne til at have bedre adgang til nyrerne. Ligate nyre vene, arterie og ureter med ikke-resorberbare 5.0 eller 6.0 sutur og fjerne nyrerne helt.
12. Sutur sår på peritoneal musklen, at indføre slutningen af kateteret så at musklen skal være mellem de to plastik ringe, som forklaret før (trin 1,5).
13. Indføre adgangsport i det subkutane rum og sutur i huden, som forklaret i trin 1,6 og 1.7.
    Bemærk: Mus bør hvile i mindst 10 dage fra disse operationer for at sår på peritoneal musklen er helt helbredt og der bliver ikke siver ind i det subkutane rum samtidig indsprøjtning af væske. Injicere væske som i trin 1.10.
14. Når efterbehandling eksperimentet, aflive dyr af kuldioxid kvælning eller livmoderhalskræft dislokation.

Figur 1 viser alle de materialer, der er forpligtet til at følge procedurerne i protokollen afsnit. I dette eksempel, mus indsendt eller ikke at nephrectomistatus (8 dyr pr. gruppe) (figur 2) blev udsat for under 40 dage (to injektioner per dag, venter på mindst 2 timer mellem begge) til en blanding af to forskellige PDF-filer, almindeligt anvendt i den kliniske praksis: Extraneal (icodextrin-baseret PDF) og Dianeal (glucose-baseret PDF). En gruppe med saltvand løsning var blev oprettet som kontrol (n = 6).

Mus parietal peritoneal væv blev indhentet fra de mest fjerntliggende område af kateteret. Prøverne blev analyseret for at sammenligne fortykkelse af membranen, samt celle tilstedeværelse og mesothelial lag bevaring (figur 3). I denne henseende er tykkelse og celle tilstedeværelse steg i dialyse, og forværret i gruppen nephrectomized. Mesothelial celler også vise en ændret morfologi da intercellulære fagforeninger lider under PD.

Serumprøver blev fremstillet af nephrectomized mus til at analysere urinstof niveauer ved at udtrække 250-400 µL af blodet via ansigtet vene punktering, på tre forskellige tidspunkter: én dag før operationer, midten af behandling og slutpunktet. For ingen nephrectomized mus, blev serumprøver kun fremstillet på slutpunktet (figur 4). Målingerne blev udført ved hjælp af en integreret kemi system (Se Tabel af materialer). Resultaterne viser, at 5/6 nephrectomistatus induceret en uræmisk tilstand, øge ureic nitrogen niveauer i løbet af eksperimentet sammenligne med den oprindelige tilstand. Desuden, når nyrerne er fuldt funktionel, ureic nitrogen niveauer forbliver lignende basal staten, selv i mus udsættes for PDF (figur 4).

Figur 1 . Materiale til operationer af nephrectomies og kateter implantation. (A) kateter og nålen (B) 6.0 ikke-resorberbare sutur, rustfrit stål stump punkt pincet, låsning klemme pincet (for at holde nålen) og stumpe saks, cauterizer og bomuld svaberprøver. Materialer skal være steriliseret før operationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 . Billeder af den højre nyre ligatur og venstre nyre ekstremer fjernelse ved at brænde med cauterizer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 . Masson's Trichrome farvning. Repræsentative billeder (400 X) af mus peritoneal membraner udsat for PDF-filer + 5/6 nephrectomistatus, PDF-filer (uden nephrectomistatus) og saltopløsning (uden nephrectomistatus). Pilene viser stigning af celleforandringer og tab af mesothelial lag integritet. Sorte linjer viser tykkelsen af den peritoneale membran, hvor den blå farvning svarer til den ekstracellulære matrix. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 . Serum ureic nitrogen niveauer (mg/dL) mus udsat for PDF løsninger, indsendt eller ikke at nephrectomistatus procedure og mus behandlet med saltvandsopløsning alene. Data repræsenteres som middelværdi og standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den første offentliggjorte data analysere PD ændringer ved hjælp af en "lukke system" teknik blev udført i 2009²⁹ . Denne tætte system betyder, at hele enheden er placeret inde i kroppen og væske sprøjtes med en nål gennem en adgangsport. De vigtigste tekniske problem i langsigtede dyremodeller væske infusion via et kateter er forekomsten af obstruktion. Mulige indstillinger er at udføre omentectomy eller tilføje heparin til PDF-filer til at reducere peritoneal sammenvoksninger. Ikke desto mindre, omentum fungerer som et forsvar orgel, og heparin, bortset fra dens antikoagulerende effekt, modulerer processer såsom inflammatoriske celler aktivitet, angiogenese, syntese af ekstracellulære matrix, og spredning af celler. Udformningen af den oprindelige enhed blev offentliggjort i 2009 blev senere forbedret for at overvinde disse problemer at reducere størrelsen på access-port og justere diameteren af kateter at lette afgangen af væske.

Dyremodeller er væsentlige til at analysere udviklingen af talrige sygdomme, samt gennemførligheden og potentiale effektiviteten af foranstaltninger, der træffes på veje involveret i sygdomme. Peritoneal væske infusion musen model kan være nyttigt for at studere en bred vifte af patologier og udvikle drug behandlingsformer. Denne model giver et fremragende værktøj for langsigtet instillation af narkotika; Vi forventer derfor, det kan bidrage til at forbedre livskvaliteten for patienter med forskellige sygdomme.

Der er to spørgsmål, der bør tages hensyn til disse eksperimenter. Den første er, at væsken er administreret i maven men ikke fjernet som i PD patienter. Først og fremmest er det vigtigt at bemærke, at disse PD-eksponering modeller, hvor formålet er at undersøge virkningerne af væsken over bughinden, ikke at fjerne vand og metabolitter. Ikke desto mindre for PD studier i mus er der ingen grund til væske fjernes hver gang, da det kan fjernes med urin. Faktisk har vi observeret at 5/6 nephrectomized mus ikke bliver edematous fordi den nyre fraktion, der er tilbage er stadig funktionel og det tidspunkt, vi forlader mellem de daglige injektioner er nok til at tisse den administrerede volumen. Desuden indebærer udvinding af væsken bedøve dyret hver dag og åbning af bughulen for at dræne det, med efterfølgende vævsskader. En anden mulighed kunne være at udtrække væske gennem kateteret, men det ville bryde sammen, fordi det vil suge organerne. En tredje mulighed er blevet offentliggjort for nylig⁴¹, men det er ikke egnet til lange behandlinger.

Det andet problem er, at indlagte katetre kan forårsage et fremmedlegeme reaktion, der kunne forstyrre resultater^42,43. Derfor, denne effekt blev undersøgt i den peritoneale membran af mus udsættes kun for tilstedeværelsen af kateteret. Resultaterne viste, at der er en fortykkelse af bughinden og ophobning af nye celler ved indsættelsesstedet. Men denne reaktion aftager gradvist i områder, der ligger fjernt fra indsætningspunktet kateter. Den peritoneale membran på siden af bughinden overfor kateteret har samme udseende som membranen af en naiv kontrol mus (data ikke vist). Derfor er det vigtigt at analysere den venstre side af peritoneal væggen når udkig morfologiske ændringer, undgå også de linea alba.

Brug af en iboende kateter undgår behovet for gentagne punkteringer i bughinden over varigheden af behandling, dermed mindske risikoen for infektion, hemoperitoneum og muligheden for at skade et orgel. Desuden, denne teknik mere nøje ligner PDF instillation procedure i menneskelige patienter. Når væsken er sprøjtes, forbliver dyret helt vågen. Det valgte område af huden er rengjort og kun adgangsport er afholdt. Det er derfor unødvendigt at holde dyr, som kan forårsage det unødig stress, og overfloediggoer til anæstesi, som kan interferere med resultaterne.

Protokol for nephrectomies først udgivet af Ferrantelli et 1t opgivet i 2015⁴⁰ er blevet ændret for at reducere området i såret for kirurgi og drage fordel af den indsnit nødvendige til udvinding af den højre nyre at indføre kateter.