Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant
Summary
Protéine de l’intégrase spumavirus prototype recombinante est souvent contaminée par une nucléase bactérienne pendant la purification. Cette méthode identifie la contamination nucléase et le supprime de la préparation finale de l’enzyme.
Abstract
La protéine de l’intégrase (IN) du virus spumeux prototype rétrovirus (PFV) est une enzyme de modèle pour l’étude du mécanisme d’intégration rétrovirale. Par rapport à po d’autres rétrovirus, PFV IN est plus soluble et plus propices à la manipulation expérimentale. En outre, il est sensible aux inhibiteurs de IN cliniquement pertinente virus d’immunodéficience humaine (VIH-1), suggérant que le mécanisme catalytique de PFV IN est similaire à ce que de l’HIV-1 po en catalyse covalente par le rattachement de viral ADN complémentaire (ADNc) à target L’ADN dans un processus appelé transfert de brin. Cette réaction de transfert de brin introduit des entailles à l’ADN cible. Analyse des produits de réaction d’intégration peut être confondue par la présence de nucléases qui nick de même ADN. Une nucléase bactérienne a été établie conjointement purifier par recombinaison PFV IN exprimé chez Escherichia coli (e. coli). Nous décrivons ici une méthode pour isoler la PFV IN de la nucléase contaminante par chromatographie d’affinité de l’héparine. Fractions sont facilement contrôlées pour contamination nucléase avec un plasmide surenroulé et électrophorèse sur gel d’agarose. PFV IN et la nucléase contaminante affichage alternatives affinités pour l’héparine Sépharose permettant une préparation exempte de nucléase de recombinant PFV IN adapté à l’analyse biochimique ou simple molécule en vrac de l’intégration.
Introduction
Des études biochimiques et unique molécule d’interactions de protéine avec de l’ADN nécessitent exceptionnellement pures protéines recombinantes. Contaminer les nucléases de bactéries peut masquer les résultats de ces tests. Une nucléase contaminante a été trouvée dans les préparations de protéines recombinantes oxygène charognard protocatéchuate-3, 4-dioxygénase (PCD) et prototype virus spumeux (PFV) intégrase (IN) isolés de Escherichia coli (e.coli)1 , 2 , 3.
Tests d’intégration rétrovirale reposent sur la conversion de l’ADN surenroulé produits entaillées ou linéaires comme une mesure de l’activité4. Au cours de l’infection cellulaire IN a rejoint les deux extrémités d’un ADNc viral à l’hôte la chromatine5. Chaque extrémité joignant la réaction est appelée transfert de brin. Dosages des recombinants en activité peut-être se joindre deux oligomères d’ADN imitant l’ADNc viral se termine vers une cible ADN dans une intégration concertée réaction4,5,6,7,8. Alternativement IN recombinant peut-être adhérer à seule fin d’ADN dans un non-physiologiquement pertinents moitié site intégration réaction9,10. Lorsque l’ADN plasmidique surenroulé est la cible d’intégration, intégration concertée produits sont linéarisés ADN et demi produits d’intégration de site sont des cercles détendues. Ces produits de réaction sont identifiés par leur mobilité relative au cours de l’électrophorèse sur gel d’agarose1. Si la recombinée IN a une nucléase contaminante, il sera fausses cercles détendues ou un plasmide linéarisé éventuellement confondre les résultats expérimentaux. Oligomères d’ADN virales peuvent être étiquetés fluorescent pour identifier avec certitude les produits d’intégration, par opposition aux produits nucléase. Cependant, dans beaucoup favorise les cibles d’ADN surenroulés ; toute perte du plasmide surenroulé cercles détendues ou ADN linéaire par nucléase contaminante pourrait biaiser les résultats et interprétation de données11. Ainsi, il est impératif de retirer les nucléases bactériennes de rétroviraux dans des préparations.
PFV IN a une affinité différente pour héparine Sépharose par rapport à la nucléase bactérienne1. PFV IN et la nucléase peuvent être séparés par une élution gradient linéaire de l’héparine sepharose. La nucléase n’est pas facilement détectée par une absorbance de rayons ultraviolette (UV) à 280 nm crête ou sur gel de polyacrylamide d’analytique sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). Au lieu de cela, la nucléase est détectée par un test d’activité nucléasique employant la conversion d’un plasmide surenroulé cercles détendues ou produits linéaires. Chaque fraction après chromatographie sur sepharose d’héparine est testée pour activité nucléasique. PFV IN et le contaminant nucléase n’ont aucune différence en affinité pour résine anionique Mono-Q. Il y a une petite différence en affinité pour la résine cationique Mono-S. Toutefois, la résolution de Mono-S de nucléase bactérienne et PFV IN n’autoriserait pas une séparation efficace des protéines. En fin de compte, purification d’affinité de l’héparine Sépharose offre la meilleure séparation des nucléases bactérienne de PFV IN et présente l’avantage de volume de charge illimitée.
Tests de contamination activité nucléasique peut être adapté à d’autres protéines. La protéine d’intérêt auront probablement des caractéristiques d’affinité alternatives à PFV IN ; la différence dans les caractéristiques de la protéine d’intérêt et le contaminant nucléase de liaison doit être déterminée empiriquement. Cette méthodologie permettant d’identifier la contamination nucléase peut être adaptée à d’autres résines, y compris des cations Mono-S ou résines échangeuses de Mono-Q anion. Résines d’affinité et échange d’ions peuvent offrir une méthode fiable pour isoler une protéine recombinante d’intérêt de contaminer les nucléases sans limite sur le volume des protéines au cours de la chromatographie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protéines recombinantes qui interagissent avec l’ADN, tels que protéines, charognards d’oxygène pour les applications de microscopie seule molécule ou integrases rétrovirale, réparation de l’ADN doivent être exempts de contamination bactérienne nucléases2,3. Ces contaminants peuvent confondre l’interprétation des résultats au cours de tests biochimiques ou simple molécule en vrac.
Nous avons trouvé qu’une nucléa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH AI099854 et AI126742 à clé.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
Referencias
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