Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında
Summary
Rekombinant prototip köpüklü virüs integrase protein genellikle arıtma sırasında bakteriyel nükleaz ile kirlenmiş. Bu yöntem nükleaz kirlenme belirler ve enzim son hazırlık kaldırır.
Abstract
Retrovirüs prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) protein retroviral Tümleştirme mekanizmasının okuyan bir model enzimdir. IN diğer Retrovirüsler, PFV inç daha çözünür ve daha deneysel manipülasyon için mükellef karşılaştırılır. Ayrıca, klinik insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) inç inhibitörleri, PFV inç katalitik mekanizması HIV-1 inç inç viral Tamamlayıcı DNA (cDNA) hedef kovalent katılmadan tromboksan benzer olduğunu ima için duyarlıdır Bir işlemde DNA strand transfer aradı. Bu strand transfer reaksiyon nickler hedef DNA tanıtır. Entegrasyon reaksiyon ürünleri analizini benzer şekilde DNA nick nükleaz varlığı ile şaşırmış. Bakteriyel nükleaz rekombinant PFV inç Escherichia coli içinde (E. coli) ifade ile birlikte arındırmak için gösterilmiştir. Burada PFV inç bulaşıcı nükleaz heparin benzeşme Kromatografi tarafından izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Kesirler kolayca nükleaz kirlenme bir supercoiled Plazmid ve özel Jel Elektroforez için tarandı. PFV inç ve bulaşıcı nükleaz heparin sepharose rekombinant PFV inç nükleaz ücretsiz hazırlanması toplu biyokimyasal veya tek molekül analiz entegrasyon için uygun izin için alternatif benzeşim görüntüler.
Introduction
Protein etkileşimler DNA ile biyokimyasal ve tek molekül çalışmaları son derece saf rekombinant proteinler gerektirir. Enzimler bakterilerden bulaşıcı bu deneyleri sonuçları belirsiz. Bulaşıcı bir nükleaz müstahzarları rekombinant proteinlerin oksijen leş protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) ve Escherichia coli (e.coli)1 ‘ den izole prototip köpüklü virüs (PFV) integrase (IN) bulundu , 2 , 3.
Retroviral Tümleştirme deneyleri dönüşüm supercoiled DNA çentik ya da doğrusal ürünler için etkinlik4bir ölçüsü olarak güveniyor. Hücresel enfeksiyon sırasında inç bir viral cDNA iki ucu ana bilgisayar Kromatin5‘ e katıldı. Her iki ucu tepki katılmadan strand transferi olarak adlandırılır. Deneyleri rekombinant IN etkinliği iki DNA reaksiyonlar katılabilir miyim viral cDNA taklit biter bir hedefe DNA’sı uyumlu entegrasyon tepki4,5,6,7,8. Alternatif olarak rekombinant inç bir fizyolojik olarak sigara ilgili yarım sitesini Tümleştirme tepki9,10‘ tek bir DNA son üye olabilirler. Supercoiled plazmid DNA hedef olduğunda Tümleştirme, uyumlu entegrasyon ürünlerdir DNA doğrusallaştırılmış ve rahat daireler yarım sitesi Tümleştirme ürünlerdir. Bu reaksiyon ürünleri özel Jel Elektroforez1sırasında onların göreceli hareketlilik tarafından tanımlanır. Rekombinant inç bulaşıcı nükleaz varsa, sahte rahat daire veya muhtemelen doğrusallaştırılmış plazmid deneysel sonuçlar kafa karıştırıcı olacak. Viral DNA reaksiyonlar fluorescently kesin nükleaz ürünleri aksine entegrasyon ürünleri tanımlayan olarak etiketlenmiş olabilir. Ancak, içinde büyük ölçüde supercoiled DNA hedefleri iyilik; rahat daireler veya doğrusal DNA bulaşıcı nükleaz tarafından supercoiled plazmid kaybı sonuçları ve veri11yorumlanması çarpık. Böylece bakteriyel nükleaz MÜSTAHZARLARI retroviral kaldırmak için zorunludur.
PFV inç için heparin sepharose bakteriyel nükleaz1‘ e göre farklı bir ilgi vardır. PFV inç ve nükleaz heparin sepharose üzerinden doğrusal bir degrade elüsyon tarafından ayrılmış. Nükleaz kolayca 280 nm pik ultraviyole (UV) Absorbans veya analitik Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) tarafından algılanmaz. Bunun yerine, nükleaz supercoiled plazmid dönüşüm rahat daire veya doğrusal ürünler için istihdam nükleaz etkinliği tahlil tarafından algılanır. Heparin sepharose Kromatografi takip her kesir nükleaz etkinlik için test edilmiştir. PFV inç ve nükleaz kirletici Mono-Q anyon reçine için ilgi hiçbir fark var. Mono-S katyon reçine için ilgi küçük bir fark vardır. Ancak, Mono-S çözünürlüğe bakteriyel nükleaz ve PFV inç proteinlerin verimli ayrılık izin vermez. Sonuçta, heparin sepharose benzeşme arıtma PFV inç sunar bakteriyel nükleaz en iyi ayrılması ve sınırsız yük hacmi bir avantaja sahiptir.
Nükleaz etkinlik kirletici için test diğer proteinler için adapte olabilir. Faiz protein alternatif benzeşimi özelliklerini PFV inç daha büyük olasılıkla olacak; protein faiz ve nükleaz kirletici özelliklerini bağlama fark ampirik olarak belirlenmelidir. Nükleaz kirlenme tanımlamak için bu yöntem Mono-S katyon veya Mono-Q anyon Satım reçineler de dahil olmak üzere diğer reçineler adapte olabilir. Benzeşme ve iyon değiştirme reçineler enzimler protein birimdeki sınırsız Kromatografi sırasında bulaşıcı üzerinden ilgi rekombinant protein izole etmek için güvenilir bir yöntem sunabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA onarım proteinler, tek molekül mikroskobu uygulamalar veya retroviral integrases, oksijen gidericiler gibi DNA ile etkileşim rekombinant proteinler bakteriyel nükleaz2,3bulaşıcı özgür olmalıdır. Bu kirleticiler sonuçları yorumlama toplu biyokimyasal veya tek molekül deneyleri sırasında karışabilir.
Biz bir bakteriyel nükleaz sık PFV inç ile birlikte arındırır olduğunu bulduk Ancak, PFV inç bakteriyel nükl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
Referencias
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
- Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
- Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
- Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
