Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase
Summary
Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.
Abstract
Das Protein Integrase (IN) des Retrovirus Prototyp schaumig Virus (PFV) ist ein Modell-Enzym für die Untersuchung des Mechanismus der retroviralen Integration. Im Vergleich zu IN aus anderen Retroviren, ist PFV IN besser löslich und besser geeignet, um experimentelle Manipulation. Darüber hinaus ist es empfindlich auf klinisch relevante humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) IN Inhibitoren, darauf hindeutet, dass der katalytische Mechanismus der PFV IN ähnlich ist, dass der HIV-1 Zoll IN katalysiert die kovalente Verbindung von viralen komplementäre DNA (cDNA) zum Ziel DNA in einem Prozess namens Strang Transfer. Dieser Transfer Strangreaktion stellt die Ziel DNA Nicks. Analyse der Reaktion Integrationsprodukte kann durch die Anwesenheit von Nukleasen, die DNA ähnlich nick verwechselt werden. Eine bakterielle Nuklease hat sich gezeigt, zusammen mit rekombinanten PFV IN ausgedrückt in Escherichia coli (E. Coli) zu reinigen. Hier beschreiben wir eine Methode um PFV IN von kontaminierenden Nuklease durch Heparin Affinitätschromatographie isolieren. Brüche werden leicht auf Nuklease Kontamination mit supercoiled Plasmid und Agarose-Gelelektrophorese überprüft. PFV IN und die kontaminierenden Nuklease anzeigen alternative Affinitäten für Heparin-Sepharose ermöglicht eine Nuklease-freie Herstellung von rekombinanten PFV IN für biochemische oder einzelne Molekül Massenanalyse Integration geeignet.
Introduction
Biochemische und einzelne Molekül Studien von Protein-Interaktionen mit DNA erfordern außergewöhnlich reinen rekombinanter Proteine. Kontaminierende Nukleasen von Bakterien kann die Ergebnisse dieser Tests verdecken. Kontaminierende Nuklease befindet sich in Vorbereitung der rekombinante Proteine Sauerstoff Fänger Protocatechuate-3,4-Dioxygenase (PCD) und Prototyp schaumig Virus (PFV) Integrase (IN) von Escherichia coli (E. Coli)1 isoliert , 2 , 3.
Retroviren Integration Tests verlassen sich auf die Umwandlung von supercoiled DNA, geklaut oder lineare Produkte als Maß für die Aktivität4. Im zellulären Infektion tritt IN die beiden Enden der viralen DNA an die Host-Chromatin-5. Jedem Ende Beitritt Reaktion wird als Strang Transfer bezeichnet. Assays von rekombinanten IN Aktivität kann beitreten zwei DNA-Oligomere imitiert die virale cDNA zu einem Ziel DNA in einem abgestimmten Integration Reaktion4,5,6,7,8endet. Alternativ kann rekombinante IN nur einem DNA-Ende nicht physiologisch relevanten halbe Seite Integration Reaktion9,10teilnehmen. Wenn supercoiled Plasmid-DNA das Ziel der ist Integration, abgestimmte Integration sind Produkte linearisiert DNA und eine halbe Seite Integrationsprodukte sind entspannt Kreise. Diese Reaktionsprodukte sind durch ihre relative Mobilität während Agarose-Gel-Elektrophorese1identifiziert. Wenn die rekombinante IN einen kontaminierenden Nuklease verfügt, werden falsche entspannt Kreise oder eine möglicherweise linearisierten Plasmid verwirrend die experimentellen Ergebnisse. Virale DNA-Oligomere können Eindringmittel markiert werden, um schlüssig Integrationsprodukte, im Gegensatz zu Nuklease Produkten identifizieren. Jedoch bevorzugt stark supercoiled DNA Ziele; der Verlust von supercoiled Plasmid entspannt Kreise oder lineare DNA von kontaminierenden Nuklease Labelling Ergebnisse und Interpretation von Daten11. So ist es zwingend notwendig, um bakterielle Nukleasen von Retroviren IN Vorbereitungen zu entfernen.
PFV IN hat eine unterschiedliche Affinität zu Heparin-Sepharose im Vergleich zu den bakteriellen Nuklease-1. PFV IN und der Nuklease können durch einen linearen Farbverlauf Elution von Heparin Sepharose abgetrennt werden. Die Nuklease ist nicht ohne weiteres durch eine ultraviolette (UV)-Extinktion auf 280 nm Höhepunkt oder analytische Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erkannt. Stattdessen wird der Nuklease durch eine Nuklease Aktivität Assay beschäftigt die Umwandlung von supercoiled Plasmid zu entspannt Kreise oder lineare Produkte erkannt. Jede Fraktion nach Heparin-Sepharose-Chromatographie wird für Nuklease Aktivität getestet. PFV IN und der Nuklease Verunreinigung haben keinen Unterschied in der Affinität für Mono-Q Anion Harz. Es gibt einen kleinen Unterschied in Affinität für Mono-S kation Harz. Jedoch würde die Mono-S-Auflösung der bakteriellen Nuklease und PFV IN effiziente Trennung der Proteine nicht zulassen. Letztlich bietet die beste Trennung von bakteriellen Nuklease aus PFV IN Heparin Sepharose Affinitätsreinigung und hat den Vorteil der unbegrenzten Ladevolumen.
Tests für kontaminierende Nuklease Aktivität kann an andere Proteine angepasst werden. Das Protein des Interesses haben wahrscheinlich alternative Affinität Eigenschaften als PFV IN; der Unterschied in der bindenden Eigenschaften des Proteins des Interesses und der Nuklease Verunreinigung muss empirisch ermittelt werden. Diese Methodik zur Ermittlung der Nuklease Kontamination kann an anderen Harzen einschließlich Mono-S kation oder Anion Austausch Harze Mono-Q angepasst werden. Affinität und Ionenaustausch Harze können eine zuverlässige Methode um eine rekombinante Protein des Interesses von kontaminierenden Nukleasen ohne Grenzen auf dem Datenträger des Proteins während der Chromatographie isolieren anbieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinante Proteine, die DNA, interagieren, wie z. B. DNA-Reparatur Proteine, Sauerstofffänger Einzelmolekül-Mikroskopie-Anwendungen oder retroviral Integrases sollte frei von kontaminierenden Bakterien Nukleasen2,3sein. Diese Verunreinigungen können die Interpretation der Ergebnisse in loser Schüttung biochemische oder einzelne Molekül Assays verwechseln.
Wir haben festgestellt, dass eine bakterielle Nuklease Co häufig mit PFV…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
Referencias
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