Overuttryck och rening av människa<em> Cis</em> -prenyltransferas i<em> Escherichia coli</em
Summary
Ett enkelt protokoll för överuttryck och rening av kodonoptimerad human cis- fenyltransferas under icke-denaturerande betingelser från Escherichia Coli , beskrivs tillsammans med en enzymatisk aktivitetsanalys. Detta protokoll kan generaliseras för produktion av andra cis- prenyltransferasproteiner i kvantitet och kvalitet lämplig för mekanistiska studier.
Abstract
Prenyltransferaser (PT) är en grupp enzymer som katalyserar kedjeförlängning av allylldifosfat med användning av isopentenyldifosfat (IPP) via flera kondensationsreaktioner. DHDDS (dehydrodolichyldifosfat-syntas) är en eukaryotisk långkedjig cis -PT (bildande cis -dubbelbindningar från kondensationsreaktionen) som katalyserar kedjeförlängning av farnesyldifosfat (FPP, ett allylldifosfat) via flera kondensationer med isopentenyldifosfat (IPP). DHDDS är av biomedicinsk betydelse, eftersom en icke-konservativ mutation (K42E) i enzymet resulterar i retinitpigmentosa , vilket slutligen leder till blindhet. Därför utvecklades föreliggande protokoll för att förvärva stora mängder renade DHDDS, lämpliga för mekanistiska studier. Här användes användningen av proteinfusion, optimerade odlingsbetingelser och kodonoptimering för att tillåta överuttryckning och rening av funktionellt aktiva humana DHDDS i <em> E. Coli. Det beskrivna protokollet är enkelt, kostnadseffektivt och tidsbesparande. Homologin av cis -PT bland olika arter föreslår att detta protokoll kan tillämpas för annan eukaryotisk cis -PT, liksom de som är involverade i syntes av naturgummi.
Introduction
Prenyltransferaser är en grupp enzymer som katalyserar kedjeförlängning av allylldifosfat med användning av isopentenyl-difosfat (IPP) via flera kondensationsreaktioner 1 , 2 . Z-typ-enzymer katalyserar bildningen av cis -dubbelbindningar från kondensationsreaktionen, medan E-typ-enzymer katalyserar trans -dubbelbindningsbildning 3 . cis -Prenyltransferases (cis -PT, Z-typ enzymer) är klassiskt klassificeras efter deras produkt kedjelängd till kortkedjiga (C 15), medellång kedja (C 50-55), och lång kedja (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyldifosfat-syntas) är en eukaryot långkedjig cis -PT som katalyserar kedjeförlängning av farnesyldifosfat (FPP, ett allylldifosfat) via flera kondensationer med isopentenyldifosfat (IPP) 1, 5 , 6 . Detta resulterar i bildning av dehydrodolichyldifosfat, ett C 55-100 polyprenyldifosfat som tjänar som en föregångare för dolichylpyrofosfat, glykosylbärarmolekylen involverad i N-bunden proteoglykosylering 1 . Bland Ashkenazi-judar resulterar en missens icke-konservativ mutation (K42E) i DHDDS i autosomal recessiv retinit pigmentosa 7 , 8 . Därför utvecklades föreliggande protokoll för att förvärva renade DHDDS som är lämpliga för mekanistiska studier.
Escherichia coli anses vara den mest bekväma och kostnadseffektiva värden för rekombinant proteinuttryck och är därför också den mest använda värden. Men när man försöker heterologiskt överuttrycka proteiner i E. coli , bör proteinspecifika överväganden göras. Hämta ordentligt vikta, aktivaE rekombinanta proteiner från E. coli , är inte en enkel fråga på grund av de olika egenskaperna hos olika proteiner. Flera tillvägagångssätt har utvecklats för att övervinna dessa hinder. Här användes användningen av proteinfusion, optimerade odlingsbetingelser och kodonoptimering för att tillåta överuttryckning och rening av funktionellt aktiva humana DHDDS i E. coli . Av anmärkning, ett tidigare försök att överuttrycka jäst cis -PT utan proteinfusion misslyckades på grund av att slutföra olöslighet även i närvaro av detergent 12. Det beskrivna protokollet är enkelt, kostnadseffektivt, tidsbesparande och låter en få DHDDS-preparat som är lämpliga för mekanistiska studier. Med tanke på homologin hos cis -PT bland olika arter, föreslår vi att detta protokoll kan tillämpas för annan eukaryot cis -PT också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här för rening av funktionella humana DHDDS i E. coli- celler är enkel och effektiv, så att man överexpressar och renar proteinet i 3-4 dagar när en lämplig konstruktion är tillgänglig. Sådana protokoll för proteinrening är av särskild betydelse med tanke på genombrott i genom-sekvensering, vilket gav en mängd information angående genetik hos många sjukdomar 18 , varigenom krävdes utveckling av hög genomströmningsmetoder för att karakterisera…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet finansierades av Israels vetenskapsstiftelsens Center for Excellence (I-CORE) inom strukturell cellbiologi (1775/12) och Israels vetenskapsstiftelse beviljar 1721/16 och 2338/16 (YH) och 825/14 (DK ). Stödet från Fields Estate Foundation till DK är mycket uppskattat. Detta arbete utfördes av Ilan Edri och Michal Goldenberg i delvis uppfyllande av MD-avhandlingskraven för Sackler-fakulteten, Tel Aviv University.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
Referencias
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
