Overexpressie en zuivering van het menselijk<em> Cis</em> -prenyltransferase in<em> Escherichia coli</em
Summary
Een eenvoudig protocol voor overexpressie en zuivering van codon-geoptimaliseerde, humane cis -prenyltransferase, onder niet-denaturerende omstandigheden, van Escherichia Coli , wordt beschreven, samen met een enzymatische activiteitstest. Dit protocol kan worden genegaliseerd voor de productie van andere cis- prenyltransferase eiwitten in hoeveelheid en kwaliteit geschikt voor mechanistische studies.
Abstract
Prenyltransferases (PT) zijn een groep enzymen die de kettingverlenging van allylic difosfaat met behulp van isopentenyldifosfaat (IPP) katalyseren via meerdere condensatie reacties. DHDDS (dehydrodolichyl difosfaat synthase) een eukaryotische langketenige cis -PT (vorming van cis-dubbele bindingen van de condensatiereactie) die ketenverlenging van farnesyl difosfaat (FPP, een allylisch difosfaat) katalyseert via meerdere condensaties met isopentenyldifosfaat (IPP). DHDDS is van biomedisch belang, aangezien een niet-conservatieve mutatie (K42E) in het enzym resulteert in retinitis pigmentosa , wat uiteindelijk tot blindheid leidt. Daarom is het onderhavige protocol ontwikkeld om grote hoeveelheden gezuiverde DHDDS te verkrijgen, geschikt voor mechanistische studies. Hierbij werd het gebruik van eiwitfusie, geoptimaliseerde kweekomstandigheden en codonoptimalisatie gebruikt om de overexpressie en zuivering van functioneel actieve humane DHDDS in <em> E. Coli. Het beschreven protocol is eenvoudig, kosteneffectief en tijdbesparend. De homologie van cis -PT tussen verschillende soorten suggereert dat dit protocol ook toegepast kan worden op andere eukaryotische cis -PT, zoals die welke betrokken zijn bij synthetische synthetische rubber.
Introduction
Prenyltransferasen zijn een groep enzymen die de kettingverlenging van allylischifosfaat met behulp van isopentenyldifosfaat (IPP) katalyseren via meerdere condensatie reacties 1 , 2 . Z-type enzymen katalyseren de vorming van cis dubbele bindingen uit de condensatiereactie, terwijl E-type enzymen trans- dubbelbindingsvorming 3 katalyseren. cis -Prenyltransferases (cis -PT, Z-type enzymen) zijn klassiek geclassificeerd volgens hun product ketenlengte in korte keten (C15), middellange-keten (50-55) en lange-keten (70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl difosfaat synthase) een eukaryotische langketenige cis -PT die ketenverlenging katalyseert van farnesyl difosfaat (FPP, een allylisch difosfaat) via meerdere condensaties met isopentenyldifosfaat (IPP) 1, 5 , 6 . Dit resulteert in de vorming van dehydrodolichyldifosfaat, een C 55-100 polyprenyldifosfaat dat als voorloper voor dolichylpyrofosfaat, de glycosyldragermolecuul betrokken bij N-gekoppelde eiwitglycosylering 1 dient . Bij Ashkenazi-joden resulteert een missense niet-conservatieve mutatie (K42E) in DHDDS autosomale recessieve retinitis pigmentosa 7 , 8 . Daarom is het onderhavige protocol ontwikkeld om zuiverde DHDDS te verkrijgen die geschikt zijn voor mechanistische studies.
Escherichia coli wordt beschouwd als de meest geschikte en kosteneffectieve gastheer voor recombinante eiwit expressie, en is daarom ook de meest gebruikte gastheer. Wanneer men echter eiwitten in E. coli heterologisch overexpresseert, moeten eiwitspecifieke overwegingen worden gemaakt. Verkrijgen van goed gevouwen, actiefE recombinante eiwitten uit E. coli , is niet een eenvoudige kwestie door de verschillende eigenschappen van verschillende eiwitten. Er zijn talrijke aanpak ontwikkeld om deze hindernissen te overwinnen. Hierbij werd het gebruik van eiwitfusie, geoptimaliseerde kweekomstandigheden en codonoptimalisatie gebruikt om de overexpressie en zuivering van functioneel actieve humane DHDDS in E. coli toe te staan . Van te voren was een eerdere poging om gist cis -PT te overexpressen zonder eiwitfusie mislukt door volledige onoplosbaarheid zelfs in aanwezigheid van detergent 12 . Het beschreven protocol is eenvoudig, kosteneffectief, tijdbesparend en maakt het mogelijk om DHDDS preparaten te verkrijgen die geschikt zijn voor mechanistische studies. Gezien de homologie van cis -PT tussen verschillende soorten, raden we aan dat dit protocol ook toegepast kan worden op andere eukaryotische cis -PT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat hier wordt beschreven voor zuivering van functionele humane DHDDS in E. coli cellen is eenvoudig en efficiënt, waardoor men het eiwit over 3-4 dagen kan uitdrukken en zuiveren zodra een geschikt construct beschikbaar is. Dergelijke protocollen voor eiwitzuivering zijn van bijzondere betekenis gegeven door de doorbraken in genoomsequentiebepaling, die veel informatie verschaft over de genetica van vele ziekten 18 , waardoor de ontwikkeling van high-throughputmethoden ver…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Israëlic Science Foundation's Center for Research Excellence (I-CORE) in de Structurele Celbiologie (1775/12) en de Israëlic Science Foundation verleent 1721/16 en 2338/16 (YH) en 825/14 (DK ). De steun van de Fields Estate Foundation naar DK wordt zeer gewaardeerd. Dit werk werd uitgevoerd door Ilan Edri en Michal Goldenberg in gedeeltelijke vervulling van de MD thesis eisen van de Sackler Faculteit Geneeskunde, Tel Aviv University.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
Referencias
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
