La surexpression et la purification de l'être humain<em> Cis</em> -prenyltransférase dans<em> Escherichia coli</em
Summary
Un protocole simple pour la surexpression et la purification de la cis- prényltransférase humaine optimisée par codon, dans des conditions non dénaturantes, d' Escherichia Coli , est décrit, avec un dosage d'activité enzymatique. Ce protocole peut être généralisé pour la production d'autres protéines de cis- prenyltransférase en quantité et en qualité adaptées aux études mécanistiques.
Abstract
Les prényltransférases (PT) sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l'aide d'isopentényl diphosphate (IPP) par de multiples réactions de condensation. DHDDS (déshydrodolichyl diphosphate synthase) est une e-eucaryote à longue chaîne cis -PT (formant des doubles liaisons cis de la réaction de condensation) qui catalyse l'allongement de la chaîne du farnesyl diphosphate (FPP, un diphosphate allylique) par de multiples condensations avec le diphosphate d'isopentényle (IPP). DHDDS est d'une importance biomédicale, car une mutation non conservatrice (K42E) dans l'enzyme résulte en une rétinite pigmentaire , entraînant finalement la cécité. Par conséquent, le présent protocole a été développé afin d'acquérir de grandes quantités de DHDDS purifié, adapté aux études mécanistiques. Ici, l'utilisation de la fusion de protéines, des conditions de culture optimisées et l'optimisation des codons ont été utilisées pour permettre la surexpression et la purification de DHDDS humain fonctionnellement actif dans <eM> E. Coli. Le protocole décrit est simple, rentable et temporaire. L'homologie de cis -PT entre différentes espèces suggère que ce protocole peut être appliqué pour d'autres eucaryotes cis -PT aussi bien, comme ceux impliqués dans la synthèse du caoutchouc naturel.
Introduction
Les prenyltransférases sont un groupe d'enzymes qui catalysent l'allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l'aide d'isopentényl diphosphate (IPP) via de multiples réactions de condensation 1 , 2 . Z enzymes de type catalysent la formation de doubles liaisons cis à partir de la réaction de condensation, alors que les enzymes de type E catalysent la formation de double liaison trans 3. Les cis- phényltransférases ( cis -PT, enzymes de type Z) sont classiquement classées en fonction de leur longueur de chaîne de produit en chaîne courte (C 15 ), moyenne chaîne (C 50-55 ) et longue chaîne (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) est un cis -PT à chaîne longue eucaryote qui catalyse l'allongement de la chaîne du farnesyl diphosphate (FPP, un diphosphate allylique) par de multiples condensations avec le diphosphate d'isopentényle (IPP) 1, 5 , 6 . Il en résulte la formation de déshydrodolichyl diphosphate, un diphosphate de polyprinyle C 55-100 servant de précurseur pour le dolichylpyrophosphate, la molécule de support de glycosyle impliquée dans la glycosylation 1 de la protéine N. Parmi les juifs ashkénazes, une mutation non conservatrice à l'échec (K42E) dans DHDDS entraîne une rétinite pigmentaire autonome récessive 7 , 8 . Par conséquent, le présent protocole a été développé afin d'acquérir des DHDDS purifiés pour les études mécanistiques.
Escherichia coli est considérée comme l'hôte le plus pratique et le plus rentable pour l'expression de protéines recombinantes et est donc également l'hôte le plus utilisé. Cependant, lorsque l'on tente de surexprimer de manière hétérologue les protéines dans E. coli , des considérations spécifiques aux protéines devraient être faites. Obtenir correctement plié, activéE protéines recombinantes d' E. coli , n'est pas une question simple en raison des propriétés distinctes de différentes protéines. De nombreuses approches ont été développées pour surmonter ces obstacles. Ici, l'utilisation de la fusion de protéines, des conditions de culture optimisées et l'optimisation des codons ont été utilisées pour permettre la surexpression et la purification de DHDDS humaines fonctionnellement actives dans E. coli . Il est à noter qu'une tentative précédente de surexpression de la levure de cis -PT sans fusion de protéines a été infructueuse en raison de l'insolubilité complète, même en présence de détergent 12 . Le protocole décrit est simple, rentable, épargnant du temps et permet d'obtenir des préparations DHDDS adaptées aux études mécanistiques. Compte tenu de l'homologie de cis -PT parmi les différentes espèces, nous suggérons que ce protocole puisse être appliqué pour d'autres eucaryotes cis -PT aussi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici pour la purification de la DHDDS humaine fonctionnelle dans les cellules de E. coli est simple et efficace, permettant de surexprimer et de purifier la protéine en 3 à 4 jours une fois qu'une construction appropriée est disponible. De tels protocoles pour la purification des protéines sont d'une importance particulière compte tenu des percées dans le séquençage du génome, ce qui a fourni une pléthore d'informations concernant la génétique de nombreuses maladies <…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le Centre d'excellence en recherche (I-CORE) de la Science Israel Science Foundation (1775/12) et la Fondation scientifique israélienne accorde 1721/16 et 2338/16 (YH) et 825/14 (DK ). Le soutien de Fields Estate Foundation à DK est très apprécié. Ce travail a été réalisé par Ilan Edri et Michal Goldenberg dans l'accomplissement partiel des exigences de thèse MD de la Faculté de médecine de Sackler, Université de Tel Aviv.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
Referencias
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