Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em> Cis</em> -prenıltransferaz in<em> Escherichia coli</em
Summary
Escherichia'dan denatüre edici olmayan koşullar altında, kodon-optimize edilmiş insan cis- preniltransferazın aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit bir protokol Coli , bir enzimatik aktivite tahlili ile birlikte anlatılmıştır. Bu protokol, mekanik çalışmalara uygun miktarda ve kalitede diğer cis- prenyltransferase proteinlerinin üretimi için genelleştirilebilir.
Abstract
Preniltransferazlar (PT), çoklu yoğunlaşma reaksiyonları yoluyla izopentenil difosfat (IPP) kullanarak allikik difosfatın zincir uzamasını katalize eden bir grup enzimdir. DHPDS (dehidrodiliden difosfat sintaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını izopentenil difosfat (IPP) ile çoklu yoğunlaştırmalar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT (yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift bağları oluşturur) 'dir. DHDDS, biyomedikal önem taşır çünkü enzimdeki muhafazakar olmayan bir mutasyon (K42E) sonuç olarak retinitis pigmentosa ile sonuçlanır ve sonuç olarak körlüğe yol açar. Dolayısıyla, mevcut protokol mekanik çalışmalar için uygun olan büyük miktarlarda saflaştırılmış DHDDS elde etmek için geliştirildi. Burada, protein füzyonu, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, fonksiyonel olarak aktif insan DHDDS'sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. <em> e. Coli. Açıklanan protokol basit, uygun maliyetli ve zaman kazandıran. Farklı türler arasındaki cis- PT'nin homolojisi, bu protokolün, doğal kauçuk sentezinde yer alanlar gibi diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermektedir.
Introduction
Preniltransferazlar, izopentenil difosfat (IPP) kullanarak alikolit difosfatın zincir uzamasını, çoklu yoğunlaşma reaksiyonları 1 , 2 yoluyla katalize eden bir grup enzimdir. Z tipi enzimler, yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift bağlarının oluşumunu katalizlerken, E-tipi enzimler, trans çift bağ oluşumunu katalize eder 3 . cis–Prenyltransferases (sis -PT, Z-tipi enzimler) klasik kısa zincirli (Cı-15), orta-zincirli (Cı-50-55) içine ürün zinciri uzunluğuna göre sınıflandırılır ve uzun zincirli (Cı-70-120 ) 4 . DHPDS (dehidrodirililik fosfat sentaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını, izopentenil difosfat (IPP) 1 ile çoklu kondansasyonlar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT'dir, 5 , 6 . Bu, N-bağlantılı protein glikosilasyonuna 1 dahil olan glikosil taşıyıcı molekül olan dolichylpyrophosphate için bir öncül olarak görev yapan bir C 55-100 poliprenil difosfat olan dehidrodoliril difosfatın oluşumuyla sonuçlanır. Ashkenazi Yahudileri arasında, DHDDS'deki bir missense muhafazakar olmayan mutasyon (K42E) otozomal resesif retinitis pigmentosa 7 , 8 ile sonuçlanır. Dolayısıyla, mevcut protokol, mekanik çalışmalar için uygun saflaştırılmış DHDDS'yi elde etmek için geliştirildi.
Escherichia coli , rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ve uygun maliyetli konak olarak düşünülür ve bu nedenle de en sık kullanılan konakçıdır. Bununla birlikte, bir heterolog olarak E. coli'deki proteinleri aşırı ifade etmeye çalışırsa, proteine spesifik hususlar yapılmalıdır. Düzgün şekilde katlanan aktiviteyi elde etmekE. rekombinant proteinlerin E. coli'den ayrılması, farklı proteinlerin farklı özelliklerinden dolayı basit bir konu değildir. Bu engellerin üstesinden gelmek için sayısız yaklaşım geliştirildi. Burada, protein füzyonunun kullanımı, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, E. coli'de işlevsel olarak aktif insan DHDDS'sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. Unutmayın, protein füzyonu olmaksızın maya cis- PT'yi aşırı ifade etme girişiminde bulunmak, deterjan 12 varlığında bile tam çözünmezlik nedeniyle başarısız olmuştur. Açıklanan protokol, basit, uygun maliyetli, zaman kazandıran ve mekanik çalışmalara uygun DHDDS preparatlarını elde etmeyi sağlar. Farklı türler arasındaki cis- PT homolojisi göz önüne alındığında, bu protokolün diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermekteyiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. coli hücrelerindeki işlevsel insan DHDDS'sinin saflaştırılması için burada açıklanan protokol, basit ve etkili olup uygun bir yapı elde edildiğinde 3-4 gün içinde proteini fazla ifade ve saflaştırmaya izin verir. Protein saflaştırma için bu gibi protokoller, böylece protein seviyesinde 19 de patojenik mekanizmalar karakterize etmek için yüksek verimli yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç, bir çok hastalık 18. genetik ilişkin bilgi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Yapısal Hücre Biyolojisi (1775/12) 'da İsrail Bilim Vakfı Araştırma Mükemmellik Merkezi (I-CORE) ve İsrail Bilim Vakfı tarafından 1721/16 ve 2338/16 (YH) ve 825/14 (DK) hibeleri ile finanse edildi. ). Fields Estate Vakfı'nın DK'ya desteği çok takdir edilmektedir. Bu çalışma, Ilan Edri ve Michal Goldenberg tarafından Tel Aviv Üniversitesi Sackler Tıp Fakültesi'nin MD tez şartlarının kısmen yerine getirilmesiyle gerçekleştirildi.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
Referencias
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
