Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.
Ontwikkeling van nieuwe microbiciden en vaccins voor Streptococcus pneumoniae (Schizophrenia) zijn noodzakelijk voor het stoppen van de snelle stijging van de meervoudige resistente stammen. Koolhydraten substraat bindende proteïnen (SBPs) vertegenwoordigen haalbare doelen voor de ontwikkeling van vaccins op basis van eiwitten en nieuwe antimicrobiële stoffen vanwege hun extracellulaire lokalisatie en de centraliteit van koolhydraten invoer voor pneumokokken metabolisme, respectievelijk. Hier beschreven is een gerationaliseerde geïntegreerde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide karakterisering van SP0092, die kan worden uitgebreid tot andere koolhydraten SBPs uit de pneumococcus en andere bacteriën. Deze procedure kan helpen het structuur gebaseerde ontwerp van remmers voor deze klasse van eiwitten. Gepresenteerd in het eerste deel van dit manuscript zijn protocollen voor biochemische analyse door thermische shift assay, multi hoek lichtverstrooiing (MALS) en uitsluiting chromatography (SEC), de grootte die het optimaliseren van de stabiliteit en homogeniteit van het monster gericht aan kristallisatie proeven en zo vergroten de kans op succes. Het tweede deel van deze procedure beschrijft de karakterisatie van de SBP kristallen met behulp van een afstembare golflengte abnormale diffractie synchrotron beamline en gegevens verzameling protocollen voor gemeten gegevens die kunnen worden gebruikt om op te lossen het gekristalliseerde eiwit structuur.
S. pneumoniae (Schizophrenia) is een gram-positieve bacterie die woonachtig zijn asymptomatically in de bovenste luchtwegen van de menselijke luchtwegen met de mogelijkheid om te migreren naar normaal steriele niches veroorzaakt otitis, sepsis, pneumonie en sepsis, en meningitis1,2. Bovendien, pneumokokken infectie is de belangrijkste oorzaak van Gemeenschap-verworven pneumonie, die tot een klinische en economische last wereldwijd3,4 bijdraagt. Antibioticum resistente stammen van S. pneumoniae hebben verspreid over de hele wereld en hoewel een zeven-valent en een dertien-valent pneumokokken eiwit geconjugeerde vaccin hebben bijgedragen aan het tarief van antimicrobiële resistentie, vervanging stammen uit verlagen vaccin gebruik naar voren zijn gekomen en hebben geleid tot hogere eisen voor onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor pneumokokken ziekte5,,6,,7,8.
De pneumococcus is afhankelijk van suikers geïmporteerd uit de host als een CO2 bron9,10; inderdaad besteedt het 30% van haar invoer apparaat voor het vervoer van 32 verschillende koolhydraten11,–12,13. Deze importeurs omvatten ten minste acht ABC-transporters13. In ABC vervoerders spelen de extracellulaire SBPs een fundamentele rol in het bepalen van de specificiteit voor de ligand en presenteert het aan de vervoerder integraal membraan voor opname in de cel. SBPs vertegenwoordigen geldige doelen voor het ontwerp van nieuwe vaccins en microbiciden, omdat ze oppervlakte-eiwitten en hun vitale rol in de cellulaire processen zijn.
Karakterisering van de eiwitten van het doel en gedetailleerde beschrijving van de structurele kenmerken, zoals ligand zakken en interdomain flexibiliteit, bieden een nuttig instrument voor structuur gebaseerde drug design14,15. Röntgendiffractie is de methode van keuze voor de structurele karakterisatie van eiwitten bij in de buurt van atomaire resolutie, maar de kristallisatie proces is onvoorspelbaar, tijdrovend en niet altijd succesvol. Systematische methoden verbeterd het slagingspercentage en belangrijke factoren zijn de steekproef kwaliteit en stabiliteit. Het slagingspercentage van kristallisatie is beïnvloed door de chemische eigenschappen van de eiwitten en de sample voorbereiding methodologie. Het effect hiervan kan worden beoordeeld en door Biochemische karakterisering16,17in kennis gesteld.
Een verdere complicatie voor structuur gebaseerde ontwerp is de kristallografische fase probleem, die moet worden aangepakt. Zoals meer eiwit structuren beschikbaar zijn gekomen, kunnen vele structuren worden opgelost door de methode van moleculaire replacement, waarvoor een homologe structuur18. SBPs presenteren een flexibele domeinstructuur, kan moleculaire vervanging ook blijken uitdagende19. Als een structureel model dat voldoende vergelijkbaar is met het doel-eiwit niet beschikbaar is, kan een aantal technieken te verkrijgen van de experimentele phasing20worden gebruikt. Onder deze, de Single-golflengte Anomalous Dispersion (ed)-methode heeft ontpopt als de primaire techniek en uitgebreid om op te lossen het probleem fase21is gebruikt. Het gebruik van de trieste methode heeft verder naar voren geschoven met verbeteringen in de hardware en software, evenals gegevens verzameling strategieën om de opsporing en het gebruik van zwakke abnormale signalen voor geleidelijke afschaffing van22,23, 24. Bovendien, voorschotten in directe methode voor het oplossen van de structuur van macromoleculen, die in het verleden diffractie gegevens naar atomaire resolutie vereiste, kan nu worden gebruikt door combineren bijvoorbeeld stereochemische kennis, zoals dit is geïmplementeerd in het programma ARCIMOLDO25. Een nuttig overzicht van methodes voor het oplossen van het probleem van de fase in de kristallografie is gegeven door Taylor26.
Hier presenteren we een gerationaliseerde protocol voor de karakterisatie van de koolhydraten vervoer SBP, SP0092 van S. pneumoniae, integratie van biochemische en structurele technieken (Figuur 1). Dit stapsgewijze protocol biedt een nuttig voorbeeld testcase van strategieën ter verbetering van het slagingspercentage van structurele studies over SBPs in het algemeen, die te in alle koninkrijken van het leven vinden zijn. Met name het protocol benadrukt het belang van het karakteriseren van de meest stabiele oligomere staat van het eiwit in oplossing in een snelle en doeltreffende methode, en de identificatie van de beste soort te volgen voor de kristallisatie experimenten kunt. Hoewel er meer dan 500 SBP structuren gemeld in de Protein Data Bank27, kan moleculaire vervanging lastig vanwege de flexibele aard van de twee α/β-domeinen, die zijn verbonden door een scharnier regio19. Dus, het tweede deel van het protocol wordt beschreven met de trieste methode voor geleidelijke afschaffing van gebonden metaalionen, die gemeenschappelijk in SBPs, evenals de opneming van selenomethionine en het gebruik van selenium (Se is) in Trieste geleidelijke.
3. Crystal karakterisering en verzamelen van de gegevens van de X-ray Crystal montage bereid de cryoprotectant-oplossing door het toevoegen van 25% (v/v) glycerol (eindconcentratie) aan de voorwaarde van de kristallisatie (dus ter vervanging van 25% van het water in de eerste mengsel) 38. Vul een schuim dewar met vloeibare stikstof en plaats het monster behuizing deel van een uni-puck in de dewar. Laat het afkoelen tot temperatuur van vloeibare stikstof. Knippen en verwijderen de afdichting van de plaat kristallisatie tape over de daling waar de kristallen worden gevormd. Breng een druppel van 1 µL van cryoprotectant oplossing op een coverslide geplaatst in de nabijheid van de daling van de target. Overbrengen van het geselecteerde kristal uit de oorspronkelijke drop naar de daling van de cryoprotectant oplossing met behulp van een nylon cryo-lus op een rug standaardgrondslag gemonteerd op een magnetische wand 39 , 40. Snel overbrengen in het kristal vanuit naar de waterdruppel cryoprotectant vloeibare stikstof, het plaatsen van de lus in de eerste lege positie van de monsterhouder uni-puck. (Uit de afdichtende tape gesneden stap) herhalen totdat alle de gewenste kristallen worden geoogst en in de uni-puck monsterhouder opgeslagen. Plaats de uni-puck baseren op de uni-puck met behulp van de toverstaf puck en neem de puck naar de beamline (in vloeibare stikstof omstandigheden). Let op: Extreem lage temperatuur! Gebruiken de cryo-Tangen en de puck dewar laden hulpmiddel voor het laden van de uni-puck(s) tot de beamline monster wisselaar robot dewar. De monsterhouder uni-puck zal losmaken van de base deksel rechtop in de robot monster verlaten van de houders van de lus monster dewar dus blootgesteld aan de vloeibare stikstof en toegankelijk naar de robot monster wisselaar. Crystal karakterisering Opmerking: de geoogste kristallen kunnen vervolgens worden gescreend voor diffractie kwaliteit met behulp van ofwel een laboratorium X-ray source of bronbelasting een X-ray synchrotronstraling (SR). Macromoleculaire kristallografie (MX) straallijnen bieden een afstembare energiebron misbruik wil maken van abnormale diffractie voor structuur oplossing. In de volgende sectie, een reeks werkvoorschriften in overeenstemming met de experimentele mogelijkheden van Diamond licht bron MX straallijnen is voorgesteld, maar deze richtsnoeren kunnen ook worden aangepast aan de MX straallijnen op andere synchrotrons wereldwijd. Als een eerste stap, is het nuttig om te bevestigen of identificeren van afwijkende scatterers in het kristal. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het meten van een spectrum van X-ray fluorescentie van het kristal. Eerst Stel de X-ray-energie van de beamline is hoog genoeg om alle elementen die doorgaans verwacht voor macromoleculaire kristallen prikkelen (14 keV of hoger). Gebruik van de software van de controle van de beamline om te selecteren het monster te worden gemonteerd door de robot monster wisselaar; de lus automatisch wordt gecentreerd in de X-ray-balk en de centrering van de kristallen kan worden bevestigd handmatig met behulp van de software van de controle van de beamline. Opnemen een X-ray fluorescentie spectrum met behulp van de software van de controle van de beamline: de gebruiker selecteert een belichtingstijd en initieert de meting (fluorescentie/fluorescentie Spectrum instelling, → uitvoeren, figuur 2A). De software van de controle van de beamline plaatst automatisch de X-ray fluorescentiedetector in plaats en bepaalt de minimale incident X-ray flux te verkrijgen van een leesbaar signaal op de fluorescentiedetector. De verworven spectrum wordt vervolgens geanalyseerd op een geautomatiseerde wijze met emissie pieken gemonteerd op natuurlijk voorkomende biologische elementen. Deze routines beschikbaar zijn binnen de beamline controle software grafische gebruikersinterface (GUI) – GDA (www.opengda.org) bij ons bedrijf en synchrotrons in heel Europa 41 , 42. Als geschikte elementen worden geïdentificeerd die kunnen worden benut voor een abnormale diffractie-experiment, uitvoeren van een X-ray absorptie rand energie scan om te bepalen van de optimale golflengte voor collectie van abnormale diffractie gegevens uit het kristal: op de beamline controle software, selecteert u het element en de scan starten (fluorescentie/fluorescentie Scan instelling, → atoom naam, → uitvoeren, figuur 2B). Opmerking: Voor een enkele afwijkende diffractie-experiment, het hoogtepunt van de absorptie rand wordt gebruikt voor het maximaliseren van de abnormale verstrooiing. Experimentele overwegingen voor het uitvoeren van een experiment multi golflengte abnormale diffractie geweest eerder gedetailleerde 43. Om te bepalen van de eenheidparameters cel crystal, symmetrie en diffractie limiet, drie röntgendiffractie patronen meten tussenpozen 45° met de trilling-methode (Data collectie/Screening → draaien current, Figuur 2C). De software van de controle van de beamline biedt de gebruiker met een keuze van trilling hoek en blootstellingstijd en de mogelijkheid om de overdracht van het percentage van de X-ray-balk. Voor een standaard crystal-screening, een hoek van de trilling van 0,5 °, een belichtingstijd van 0,5 s, en 5% X-ray lichtbundel transmissie worden aanbevolen. De gemeten diffractie-beelden worden automatisch geanalyseerd door de pijpleiding EDNA en een set van strategieën voor de collectie van een volledige gegevensset 22 retourneren. X-ray gegevensverzameling Opmerking: de gebruiker kan selecteren om gegevens in de standaard-interstadiaal modus of inverse beam-modus, waarmee Friedel stuurlieden dicht worden geregistreerd in de tijd en X-ray dosis, en met ongeveer hetzelfde absorptie gedrag te verzamelen het toestaan van een meer nauwkeurige meting van abnormale verschillen. De laatste is handig, vooral als kleine abnormale verschillen worden verwacht en/of de monsters straling gevoelig zijn bij het uitvoeren van een abnormale diffractie-experiment. Beschouwingen over de beste strategieën van de verzameling van de gegevens te gebruiken zijn volledig herziene 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. met behulp van de software van de controle van de beamline, het importeren van de collectie parameters zoals voorgesteld door het programma van de strategie die zal bieden: i. beginpositie van de ω-rotatie-as ii. Breedte van de trilling van de ω-as rotatie hoek voor elke afbeelding diffractie iii. Belichtingstijd voor elke afbeelding diffractie iv. Aantal afbeeldingen voor een volledige dataset (niet indirect de totale ω-as rotatiehoek voor de hele gegevensverzameling definiëren) v. Percentage van demping van de X-ray-balk om overmatige blootstelling en straling schade te voorkomen Opmerking: bij onze instelling voor met het verzamelen van gegevens, de pijpleidingen software voor geautomatiseerde verwerking van de verzamelde gegevens zijn goed ingeburgerd: (i) de diffractie gegevens worden verlaagd (geïndexeerde, geïntegreerde en geschaald) door de xia2-pijpleiding, die genereert reflectie mtz bestanden voor de gebruiker als input voor een geleidelijke en structuur van de oplossing/verfijning 48. (ii) wanneer een aanzienlijke afwijkend signaal wordt gedetecteerd tijdens data-analyse, een eerste snelle geautomatiseerde structuur oplossing pijpleiding (fast_ep) met behulp van SHELX probeert op te lossen van de zware atoom onderbouw door experimentele fasering, het verstrekken van een gefaseerde elektronen dichtheid kaart Wanneer dat haalbaar is. Een tweede meer omvattende structuur oplossing pijpleiding verbindt automatisch pogingen op te lossen en de structu bouwenopnieuw met behulp van onafhankelijke software suites 49 , 50 , 51 , 52; in gevallen waar dit succesvol is, zal de gebruiker worden voorzien van een eerste model en elektron dichtheid kaart. Dit vormt de basis voor de gebruiker om te voltooien van verfijning en valideren van het model met de kristallografische software suites van keuze.
In deze paper, we beschrijven en valideren van een geïntegreerde protocol voor biochemische en structurele karakterisatie van SBPs koolhydraten met een specifieke nadruk op eiwitten van S. pneumoniae. Niettemin, dit kan worden gebruikt als een standaardprocedure voor de analyse van andere SBPs uit verschillende organismen en zelfs andere niet-verwante oplosbare eiwitten.
Het eerste deel van het protocol is gericht op het verstrekken van biochemische informatie over eiwitstabiliteit en quaternaire structuur, die kan worden benut bij de voorbereiding van EiwitSteekproeven voor kristallisatie. In de sectie thermische shift testen beschrijven we alleen de pH en NaCl concentratie variaties het algemene karakter van deze procedure te handhaven. Ondanks dit, vele andere aandoeningen in de buffer kunnen worden getest op een gelijkaardige manier, bijvoorbeeld, met inbegrip van een chemische verbinding die als een stabiliserende additief gebruikt: met name de werkelijke ligand(s) die zich aan een specifieke SBP binden zijn opmerkelijk effectief in het verhogen van de Tm door een paar graden Celsius31. In sommige gevallen kunnen het denatureren curven slecht worden gedefinieerd als gevolg van lage signaal of een achtergrond van hoge fluorescentie, die wordt veroorzaakt door de aggregatie van eiwitten of gedeeltelijke ontvouwen. Om dit te voorkomen, kan een eiwit: kleurstof titratie worden uitgevoerd om de onduidelijk denatureren curven optimaliseren. Geen verbetering wordt verkregen, screening van verschillende additieven die de stabiliteit van het eiwit verbeteren kunnen wordt geadviseerd als geschikte schermen geweest eerder beschreven54.
Meestal de meeste SBPs zijn monomeer in hun natuurlijke omgeving, maar zoals hier multimerization kan optreden bij de hogere concentraties gebruikt in kristallisatie experimenten, dus de oligomerisatie gedrag karakterisering geboden door MALS en SEC is van essentieel belang om de meest gunstige stabiel monodispers oligomerisatie toestand voor kristallisatie te beoordelen. Het is echter moeilijk te voorspellen van het effect van verschillende chemische stoffen die zijn opgenomen in de voorwaarde van de kristallisatie van het gedrag van de oligomerisatie van de eiwitten. Als de SEC en MALS onderzoek uitgebreide aggregatie van de eiwitSteekproef toont, adviseren wij het volgende aan het verminderen van de kans dat dit zich voordoet: verse eiwitSteekproef (niet bevriezen-ontdooid) gebruiken en uitbreiden van de stabilisatie-analyse uitgevoerd met thermisch Shift testen, testen mogelijk additieven en milde detergenten als een laatste resource, tot een minimum beperken van aggregatie. In deze paper presenteren we basisrichtsnoeren voor kristallisatie high-throughput sparse matrix commerciële kristallisatie screening met het algemene karakter van dit protocol te handhaven. Echter het verkrijgen van hoge-resolutie röntgendiffractie eiwit kristallen wellicht iteratieve fijnafstemming voor het optimaliseren van de kristallisatie voorwaarden met betrekking tot de precipitant concentratie, pH, toevoeging van chemische additieven, verschillende temperaturen, en andere factoren de veranderende dynamica van het evenwicht tussen de kristallen druppel en reservoir16,17.
Het tweede deel van het protocol wordt de karakterisatie van de eiwit-kristallen beschreven ter vaststelling van de optimale strategie voor röntgendiffractie gegevensverzameling met een specifieke focus op de verwerving van afwijkende gegevens voor triest geleidelijke. Zelfs als SBPs een soortgelijke algemene architectuur handhaven (en er vele gedeponeerde 3D structuren mogelijk bruikbaar zijn als startende modellen), fasering van deze eiwitten door de methode van de moleculaire replacement is niet altijd eenvoudig vanwege de variabiliteit van de secundaire structuur elementen en de intrinsieke flexibiliteit van deze proteïnen. Vandaar, wij stellen de trieste methode en benadrukken dat deze proteïnen reeds hebben intrinsiek gebonden kunnen metalen of inderdaad niet-specifieke binding van metalen uit de kristallisatie buffer voorwaarden, die een aantal abnormale buigingsinrichting elementen zoals bieden kunnen een standaard stap in onze algemeen protocol.
Kortom, definieert dit protocol een standaard begeleide werkstroom van procedures waardoor de gedetailleerde beschrijving van de biochemische en structurele kenmerken van de SBPs die kunnen worden benut om het verhogen van het slagingspercentage van structuur vastberadenheid, evenals het versnellen de structurele karakterisatie van SBPs in het algemeen.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen OPPF-UK voor hulp bij het klonen, Gemma Harris voor SEC-WINKELCENTRA en de wetenschappers van de straallijnen I03 en I04 bij Diamond lichtbron.
SelenoMethionine Medium Complete | Molecular Dimensions | MD12-500 | Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies. |
MicroAmp Optical 96-Well plate | Applied Biosystems | 4306737 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers. |
SYPRO Orange | Molecular Probes | S6651 | SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions. |
MicroAmp Optical Adhesive film | Applied Biosystems | 4311971 | The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background. |
7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software. |
Superdex 200 increase 10/300 GL column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques. |
DAWN HELEOS II | Wyatt | DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided. | |
Superdex 200 5/150 GL | GE Healthcare | 28906561 | Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use. |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography. |
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate | MiTeGen | XQ-P-24S-A | The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips. |
PCT Pre-Crystallization Test | Hampton | HR2-140 | The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening. |
96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 6098xx | Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult. |
Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide – includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA) |
Standard Foam Dewar | Molecular Dimensions | MD7-35 | 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity. |
Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton | HR4-955 | Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools. |
CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part. |