JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Published: October 02, 2017
doi:
10.3791/56294
, , ,
1Diamond Light Source,Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell,Harwell Science & Innovation Campus

Summary

ويرد بروتوكول مبسط للقيام توصيف البيوكيميائية وهيكلية واسعة بروتين ملزمة الركازة الكربوهيدرات من العقدية الرئوية .

Abstract

تطوير اللقاحات ومضادات جديدة العقدية الرئوية (بنيوموكوككوس) ضرورية لوقف الارتفاع السريع في سلالات مقاومة متعددة. الكربوهيدرات الركازة ملزم البروتينات (سببس) تمثل أهدافا قابلة للاستمرار لتطوير لقاحات القائم على البروتين ومضادات جديدة بسبب تلك الترجمة خارج الخلية والدور المركزي لاستيراد الكربوهيدرات الأيض المكوّرات الرئوية، على التوالي. الموصوفة هنا هو بروتوكول متكامل ترشيد القيام بوصف شامل ل SP0092، التي يمكن أن تمتد إلى سائر الكربوهيدرات سببس من بنيوموكوككوس والبكتيريا الأخرى. هذا الإجراء يمكن أن يساعد تصميم الهيكل القائم لمثبطات لهذه الفئة من البروتينات. عرضت في الجزء الأول من هذه المخطوطة بروتوكولات لتحليل الكيمياء الحيوية بمقايسة التحول الحراري، متعدد زاوية تشتت الضوء (مالس)، وحجم الاستبعاد اللوني (ثانية)، وتحسين الاستقرار وتجانس العينة الموجهة إلى تبلور المحاكمات وذلك يعزز احتمالات النجاح. ويصف الجزء الثاني من هذا الإجراء وصف استخدام بيامليني السنكروتروني حيود شاذة الطول موجي الانضباطي، وبروتوكولات جمع البيانات لقياس البيانات التي يمكن استخدامها لحل البروتين تبلور بلورات الاستراتيجية والخطة الاستشرافية الهيكل.

Introduction

س. الرئوية (بنيوموكوككوس) بكتيريا إيجابية المقيمين أعراض في الخطوط الجوية العليا من الجهاز التنفسي البشرية مع القدرة على الهجرة إلى منافذ عقيمة عادة يسبب التهاب الإذن، الالتهاب الرئوي، وتعفن الدم، تسمم الدم، و التهاب السحايا،من12. وعلاوة على ذلك، هو عدوى المكوّرات الرئوية السبب الرئيسي للالتهاب الرئوي المجتمع المكتسبة، مما يسهم في أعباء الاقتصادية والطبية في جميع أنحاء العالم3،4. سلالات مقاومة للمضادات الحيوية من س. الرئوية قد انتشرت في جميع أنحاء العالم، وعلى الرغم من أن ساعدت سبعة-بالينت وثلاثة عشر-بالينت بروتين المكوّرات الرئوية المتقارنة لقاح خفض معدل مقاومة مضادات الميكروبات، استبدال سلالات من وقد برزت استخدام اللقاحات قد أدت إلى ازدياد الطلب على البحث في تطوير علاجات جديدة لمرض المكوّرات الرئوية5،6،،من78.

بنيوموكوككوس يعتمد على السكر المستوردة من البلد المضيف ك9،الكربون مصدر10؛ والواقع أنه يكرس 30% أجهزتها استيراد لنقل 32 الكربوهيدرات مختلفة11،،من1213. وتشمل هذه المستوردين ABC-الناقلون ثمانية على الأقل13. في أي بي سي الناقلين، سببس خارج الخلية تلعب دوراً أساسيا في تحديد الخصوصية ليجند وتقديمه إلى الناقل غشاء لا يتجزأ لامتصاص في الخلية. سببس تمثل أهدافا صالحة لتصميم لقاحات جديدة ومضادات لأنهم البروتينات السطحية ودورها الحيوي في العمليات الخلوية.

توصيف البروتين المستهدف ووصف مفصل للسمات الهيكلية، مثل جيوب يجند والمرونة بين المجالات، توفر أداة مفيدة للمخدرات على أساس هيكل تصميم14،15. علم البلورات بالأشعة السينية هو الأسلوب المفضل لتوصيف الهيكلية للبروتينات في القرب من القرار الذري، ولكن عملية تبلور لا يمكن التنبؤ بها، وتستغرق وقتاً طويلاً، ولم تكن ناجحة دائماً. وتحسنت أساليب منهجية معدل النجاح وهي عوامل هامة نوعية العينة والاستقرار. ويتأثر معدل نجاح تبلور البروتين الخصائص الكيميائية ومنهجية إعداد عينة. ويمكن تقييم أثر هذه وأبلغ بتوصيف البيوكيميائية16،17.

مضاعفات أخرى لتصميم الهيكل القائم هو المشكلة بلورية المرحلة التي يجب معالجتها. كما أصبحت أكثر البروتين الهياكل المتوفرة، يمكن حل العديد من الهياكل بطريقة استبدال الجزيئية، الأمر الذي يتطلب هيكل مثلى18. كما سببس الراهن بنية مجال مرنة، استبدال الجزيئية قد يثبت أيضا تحديا19. إذا لم يتوفر نموذج هيكلي مشابه بما فيه الكفاية للبروتين المستهدف، يمكن استخدام عدد من التقنيات للحصول على مراحل تجريبية20. ومن بين هذه الأسلوب تشتت الشاذة طول موجي واحد (SAD) برز كتقنية أساسية، وقد استخدمت على نطاق واسع لحل مشكلة المرحلة21. تم استخدام أسلوب حزين قدما مع تحسينات في الأجهزة والبرامج، فضلا عن استراتيجيات جمع البيانات للسماح باكتشاف واستخدام الإشارات الشاذة الضعف التدريجي2322،، 24. وعلاوة على ذلك، التقدم في أساليب مباشرة لحل هياكل الجزيئات الكبرى، التي كانت في الماضي تتطلب البيانات حيود القرار الذري، يمكن الآن استخدامها عن طريق على سبيل المثال، الجمع بين معارف الخبراء بتنفيذها في البرنامج أرسيمولدو25. وتعطي استعراضاً مفيداً لأساليب لحل مشكلة المرحلة في علم البلورات تايلور26.

هنا نقدم بروتوكول ترشيدا لتوصيف الكربوهيدرات النقل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية، SP0092 س. الرئوية، إدماج تقنيات الكيمياء الحيوية والهيكلية (الشكل 1). يوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة حالة اختبار مثالاً مفيداً لاستراتيجيات لتحسين معدل نجاح دراسات الهيكلية في سببس بشكل عام، التي توجد في جميع الممالك من الحياة. على وجه الخصوص، البروتوكول يبرز أهمية تميز الدولة oligomeric الأكثر استقرارا من البروتين في الحل بطريقة سريعة وفعالة، ويتيح تحديد الأنواع أفضل متابعة لبلورة التجارب. ورغم أن هناك ما يزيد على 500 الهياكل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية في “مصرف بيانات البروتين”27، يمكن أن يكون تحديا الاستبدال الجزيئي نظراً لطبيعة المرونة المتأصلة بين المجالات α/β، التي ترتبط ب منطقة مفصلي19. وهكذا يصف الجزء الثاني من البروتوكول استخدام أسلوب حزين للتخلص التدريجي من الأيونات المعدنية ملزمة، وهي مشتركة في سببس، فضلا عن إدراج سيلينوميثيونيني واستخدام السيلينيوم (Se) في مراحل الحزن.

Protocol

ملاحظة: تسلسل الترميز الذي يتم حذف إشارة الببتيد هو المستنسخة في ناقلات بوبينف بعد بروتوكول قياسي في الانصهار؛ ويتم التعبير عن البروتين الأصلي انصهار صاحب علامة في خلايا الإشريكيّة القولونية BL21 رشيد 28 ، 29-أعرب selenomethionine المسمى البديل عن اتباع الأساليب القياسية وفقا للشركة المصنعة 30. المؤتلف الاستراتيجية والخطة الاستشرافية يتم تنقيتها كما سبق وصف 32 من 31 ،. 1-“توصيف البيوكيميائية” الحرارية تحول الإنزيم 48 إعداد المخزن المؤقت الحلول مع الرقم الهيدروجيني بدءاً من 4.0 إلى 9.5 وتركيز كلوريد الصوديوم من 0 إلى 0.5 متر، والاستغناء عن 40 ميليلتر في صفيحة 96-جيدا كما هو موضح في الجدول 1 33- إضافة إلى كل ميليلتر جيدا 5 من الحل الاستراتيجية والخطة الاستشرافية بتركيز 1-2 مغ/مل. إضافة إلى كل ميليلتر جيدا 5 من 20 x الفلورسنت وصمة عار للبروتينات (انظر الجدول للمواد)- ميكس الحلول التي بيبيتينج وختم اللوحة باستخدام فيلم لاصق شفاف، وتدور لمدة 2 دقيقة في 112 x ز في درجة حرارة الغرفة- تشغيل التجربة على جهاز في الوقت الحقيقي: تعيين منحدر درجة حرارة من 3 درجة مئوية/دقيقة من 4 إلى 99 درجة مئوية مع وقت الانتظار s 10، وتقرأ في الأسفار كل 0.5 درجة مئوية مع الإثارة في 483 شمال البحر الأبيض المتوسط والانبعاثات في 568 نانومتر. تحليل منحنيات fluorescence الانبعاثات لكل حالة المخزن المؤقت، وتحديد درجة حرارة ذوبان (T m) بوصفها الحد أدنى المشتقة من – ملاحظة: هذا الإجراء يعطي مؤشرا جيدا لأن أفضل حل المخزن المؤقت للمساعدة في تحسين الاستقرار البروتين. اختر نطاق درجة الحموضة وتركيز الملح استناداً إلى شرط المخزن المؤقت مع تي أعلى م وإضافة 2.5% (v/v) من الجلسرين و 0.5 مم من tris(2-carboxyethyl) الفوسفين (تسيب) تعريف الحل المخزن المؤقت للخطوات التالية (SEC-المخزن المؤقت). مالس والتحليلية في الثانية أداء يغسل حجم عمودين العمود الترشيح جل معبأة مسبقاً مع يطرد المياه المصفاة (استخدام عمود مل 24 وزن الجزيئي واسعة نطاق). الاتصال العمود للكشف عن تشتت الضوء وحجته العمود مع العزم الثانية-المخزن المؤقت من مقايسة التحول الحراري. حقن 100 ميليلتر من الاستراتيجية والخطة الاستشرافية المنقاة في 5 ملغ/مل متوازن ثانية العمود وتدفق عمود واحد إلى حجم المخزن المؤقت ثانية. تحقق chromatogram شطف لواحد أو عدة قمم وفحص البيانات ونثر باستخدام برمجيات التحليل، الحصول على كتلة المولى ومؤشر بوليديسبيرسيتي لجميع الأنواع- ملاحظة: لكل ذروة المقابلة لأنواع أوليجوميريك، أنه من المفيد للتحقق من بوليديسبيرسيتي حساب مؤشر المولى الكتلة المرجحة في الإعلام الجماهيري/المولى مرجح على عدد من الجزيئات (Mw/Mn). تشير قيمة بوليديسبيرسيتي ما يقرب من 1 إلى ذروة مونوديسبيرسيد. ملاحظة: حالما يتم تعريف جميع أنواع أوليجوميريزيشن، يكون من المفيد دراسة اعتمادهم على تركيز البروتين، كما قد تركيزات أعلى لصالح أكبر oligomer تشكيل. تنفيذ تشغيلات ثانية تحليلية متعددة؛ وحقن 100 ميليلتر من الاستراتيجية والخطة الاستشرافية المنقاة في زيادة تركيزات (0.1-10 ملغ/مل) في العمود الترشيح جل متوازن (استخدام عمود 5 مل وزن الجزيئي واسعة نطاق) وتدفق حجم عمود واحد من المخزن المؤقت ثانية في كل مرة. تحقق chromatogram شطف لواحد أو عدة قمم وتحليل كثافة امتصاص في 280 nm منحنيات المقابلة لتركيزات البروتين انطلاق مختلفة. إذا كانت كثافة نسبية من قمم مختلفة تظل ثابتة، ثم لا تحويل بين الوكالات بين الأنواع أوليجوميريك الحالية. التباين في كثافة نسبية بتركيزات مختلفة هو دليل على إينتيركونفيرسيون بين مختلف الأنواع أوليجوميريك التي تعتمد على تركيز البروتين. ملاحظة: هذه الخطوة وصف أساسي لتحديد الأنواع التي هي أكثر ملاءمة لبلورة. في الواقع، هم أكثر عرضه لبلورة إذا كانوا في حالة oligomeric مطرد بتركيز محدد الأنواع المتميزة مونوديسبيرسيد. 2. إعداد البروتين وتبلور أغسل “ثانية محضرة” بعد حجم عمود واحد مع يطرد المياه المصفاة، حجته مع المخزن المؤقت ثانية العمود الترشيح محضرة جل معبأة مسبقاً (الوزن جزيئي واسعة 120 مل عمود)- 1-5 مل من الاستراتيجية والخطة الاستشرافية المنقاة في 5-50 مغ/مل بحقن متوازن هلام الترشيح العمود وتدفق عمود واحد حجم المخزن المؤقت ثانية. جمع في عمود التدفق من خلال في الكسور 1 مل. تجمع الكسور المقابلة إلى ذروة مونوديسبيرسي واحدة؛ وتدور العينة في 15 مل مرشحات الطرد المركزي في 1,500 ز وقياس التركيز حتى يتحقق التركيز المطلوب (عادة 50-100 مغ/مل ل SP0092)- تبلور تحديد نطاق التركيز الأمثل لبلورة التجربة باستخدام “اختبار” ما قبل تبلور كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة: Dispense 0.5-1.0 مل لكل اختبار تبلور أربعة الحلول في خزان مختلفة لجلسة 24-كذلك إسقاط لوحة التبلور. إعداد قطرات تبلور بخلط 1 ميليلتر من البروتين الحل مع 1 ميليلتر من خزان الحل وختم اللوحة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة للا أقل من 1 (يتم الحصول على نتائج أكثر موثوقية بعد الحضانة بين عشية وضحاها) ح. التحقق من جودة إسقاط لكل تركيز باستخدام مجهر تكبير 10 س. ملاحظة: اختبار تركيز البروتين مختلفة على الأقل ثلاثة: (ط) معظم قطرات تبقى واضحة تشير إلى أن البروتين مخفف جداً لبلورة؛ (ثانيا) وجود ترسبات الثقيلة في أغلبية القطرات يعني بتركيز عالية للغاية؛ وحدوث (ثالثا) متوازنة قطرات واضحة ومتسرعا (أفضل إذا كانت خفيفة) مؤشر جيد على أن تركيز اختبار ملائم لبلورة. يعد انخفاض 96-جيدا للجلوس لوحات التبلور؛ والاستغناء عن 100 ميليلتر من الحل تبلور تجارية مختلفة في كل خزان جيدا 34 ، 35 ، 36 ، 37- nL الاستغناء عن 100 عينة البروتين في تركيز محدد مسبقاً (الخطوة 1.1.6) في جميع الآبار قطره تبلور باستخدام نظام روبوتية تبلور. حلول nL الاستغناء عن 100 خزان مختلفة لبلورة المقابلة إسقاط الآبار لخلط مع البروتين في خطوة 2.2.3. إغلاق لوحة التبلور تجنب التبخر وتمكين الموازنة انخفاض تبلور مع الخزان. التحقق من قطرات دورياً (في البداية كل 1-2 يوما، وبعد كل أسبوع) (على الأقل) باستخدام حرف x 10 مجهر التكبير لتقييم تشكيل الكريستال ونمو. ملاحظة: نظام تصوير الآلي لبلورة البروتينات يمكن أن تستخدم ليسقط التصور والالتقاط. 3. توصيف كريستال وجمع بيانات الأشعة السينية كريستال تصاعد إعداد الحل كريوبروتيكتانت بإضافة 25% (v/v) من الجلسرين (تركيز النهائي) إلى حالة تبلور (وبالتالي الاستعاضة عن 25 في المائة مياه في الأولى خليط) 38- ملء رغوة ديوار مع النتروجين السائل ومكان الجزء الضميمة عينة من يوني-عفريت إلى ديوار. السماح لتبرد إلى درجة حرارة النتروجين السائل. قطع وإزالة الختم الشريط من لوحة تبلور على مدى الانخفاض حيث تتشكل البلورات. ضع قطره 1 ميليلتر من محلول كريوبروتيكتانت على كوفيرسليدي المتمركزة بالقرب من الهبوط المستهدف. نقل كريستال مختارة من إسقاط الأصلي إلى حل كريوبروتيكتانت انخفاض استخدام نايلون cryo-حلقة في قاعدة العمود الفقري قياسية التي شنت على 39 ، عصا مغناطيسية 40- بسرعة نقل الكريستال من إسقاط كريوبروتيكتانت للنتروجين السائل، وضع الحلقة في موضع فارغ الأول صاحب العينة يوني-عفريت- كرر (من الخطوة قص الشريط الختم) إلى جميع بلورات المطلوب يتم حصادها وتخزينها في صاحب العينة يوني-عفريت- مكان يوني-عفريت إسناد يوني-عفريت استخدام عصا الصولجان وتأخذ عفريت إلى بيامليني (تحت ظروف النتروجين السائل). تنبيه: الغاية انخفاض درجة حرارة! استخدام البرد-ملقط وعفريت ديوار تحميل أداة تحميل يوني-puck(s) إلى الروبوت مغير عينة بيامليني ديوار. سيتم فصل صاحب العينة يوني-عفريت من غطاء قاعدة ترك أصحاب حلقة عينة تستقيم في الروبوت عينة ديوار وهكذا يتعرض للنتروجين السائل وموجودا للروبوت مغير عينة. توصيف كريستال ملاحظة: يمكن ثم فحص بلورات المقطوع لجودة الحيود باستخدام أما مصدر الأشعة سينية مختبر أو في مصدر الأشعة سينية إشعاع السنكروتروني (SR). بيملينيس البلوري الجزيئات (MX) توفير مصدر للطاقة الانضباطي لاستغلال حيود الشاذ لهيكل الحل. في المقطع التالي، ويقترح سلسلة من تعليمات العمل تماشيا مع قدرات تجريبية من بيملينيس الماس MX مصدر الضوء، ولكن أيضا يمكن أن تتكيف هذه المبادئ التوجيهية بيملينيس MX في سينتشروترونس الأخرى في جميع أنحاء العالم. كخطوة أولى، فإنه من المفيد تأكيد أو تحديد عدسات الشاذة في البلورة. وهذا يمكن تحقيق مريح بقياس طيف الأشعة سينية الأسفار من البلورة. أولاً تأكد من تعيين طاقة الأشعة السينية بيمليني عالية بما يكفي لإثارة جميع العناصر المتوقعة عادة لبلورات الجزيئات (14 فولط أو أعلى)- استخدام برامج التحكم بيامليني لتحديد العينة التي سيتم تحميلها بالروبوت مغير عينة؛ وسيتم توسيط الحلقة تلقائياً في حزمة الأشعة السينية والتوسيط كريستال يمكن تأكيد يدوياً باستخدام برامج التحكم بيامليني- تسجيل طيف الأسفار بالأشعة سينية استخدام برمجيات التحكم بيمليني: المستخدم تحديد وقت تعرض، ويبدأ القياس (الأسفار/Fluorescence “الطيف الإعداد”، → تشغيل، الشكل 2 أ). تلقائياً مواقع برامج التحكم بيامليني الأشعة السينية كاشف fluorescence في مكان ويحدد الحادث الدنيا التمويه بالأشعة السينية للحصول على إشارة لقراءة على الكاشف ومضان. ثم يتم تحليل الطيف المكتسبة بطريقة إليه مع قمم الانبعاثات مزودة بشكل طبيعي العناصر البيولوجية. تتوفر هذه الإجراءات داخل بيامليني مراقبة البرمجيات واجهة المستخدم الرسومية (GUI)-GDA (www.opengda.org) في شركتنا وفي سينتشروترونس في جميع أنحاء أوروبا 41 ، 42- إذا تم تحديد العناصر المناسبة التي يمكن أن تستغل لتجربة حيود شاذة، إجراء فحص الطاقة حافة امتصاص الأشعة سينية لتحديد الطول الموجي الأمثل لجمع البيانات حيود الشاذة من الكريستال: على بيامليني التحكم في البرنامج، حدد العنصر وبدء المسح الضوئي (الأسفار/Fluorescence “مسح الإعداد”، → اسم الذرة، → تشغيل، الشكل 2B). ملاحظة: يستخدم ذروة حافة امتصاص لتجربة حيود شاذة واحدة، إلى أقصى حد ممكن نثر الشاذة. اعتبارات تجريبية لأداء تجربة حيود شاذة متعددة الطول موجي قد تم سابقا مفصلة 43- لتحديد معلمات خلية وحدة كريستال والتماثل، والحد حيود، قياس ثلاثة أنماط حيود الأشعة السينية على فترات 45 درجة استخدام أسلوب التذبذب (جمع البيانات والفرز → تشغيل الحالية، الشكل 2). برامج التحكم بيمليني يوفر للمستخدم مع خيار من زاوية التذبذب ووقت التعرض، والقدرة على تعيين النسبة المئوية انتقال شعاع الأشعة السينية. لفحص كريستال قياسية، ينصح بزاوية التذبذب 0.5 °، وقت تعرض 0.5 s، وانتقال شعاع أشعة إكس 5%. الصور قياس حيود تلقائياً يتم تحليلها بواسطة خط أنابيب إدنا وإرجاع مجموعة من الاستراتيجيات لجمع مجموعة كاملة من البيانات 22- الأشعة السينية جمع البيانات ملاحظة: يمكن للمستخدم تحديد لجمع البيانات في وضع معيار التذبذب أو وضع شعاع معكوس، التي تمكن الأصحاب فريدل بتسجيلها قريبة في الوقت وجرعة الأشعة السينية، ومع تقريبا نفس السلوك الاستيعاب يتيح قياس أكثر دقة للاختلافات الشاذة. هذا الأخير مفيد خاصة إذا كانت الاختلافات الشاذة الصغيرة من المتوقع و/أو العينات من الإشعاع الحساسة عند القيام بتجربة حيود شاذة. وكانت الاعتبارات المتعلقة بأفضل استراتيجيات جمع البيانات استخدام استعراض شامل 22 ، 23 ، ، من 44 45 ، 46 ، 47-استخدام برمجيات التحكم بيمليني، استيراد المعلمات جمع البيانات كما اقترح البرنامج الاستراتيجية التي سوف توفر: موضع البدء أولاً محور دوران ω الثاني. زاوية العرض التذبذب التناوب ω-محور لكل صورة الحيود الثالث. وقت التعرض لكل صورة الحيود الرابع. عدد من الصور لمجموعة بيانات كاملة (غير مباشر تحديد زاوية الاستدارة مجموع ω-محور لجمع بيانات بأكملها) ف. النسبة المئوية لتوهين شعاع الأشعة السينية لتفادي أضرار الإشعاع والتعرض المفرط ملاحظة: في مؤسستنا، ل تشغيل عملية جمع البيانات، خطوط الأنابيب البرمجيات للتجهيز الآلي للبيانات المجمعة راسخة: يتم تقليل البيانات (ط) الحيود (مفهرسة والمتكاملة، وتحجيم) بخط الأنابيب xia2، الذي يقوم بإنشاء ملفات mtz انعكاسا للمستخدم كمدخل ل الحل/التحسين التدريجي وهيكل 48. (ثانيا) عندما يتم الكشف عن إشارة شاذة كبيرة أثناء تحليل البيانات، أول هيكل إليه سريعة حل أنبوب (fast_ep) باستخدام شل محاولات حل الهيكلية ذرة ثقيلة بالتجريبية التدريجي، وتوفير خارطة كثافة الإلكترونات تدريجيا حيثما كان ذلك ممكناً. أنبوب النفط حل هيكل ثاني أشمل تتعهد تلقائياً المحاولات الرامية إلى حل، وبناء ستروكتوإعادة استخدام البرمجيات المستقلة أجنحة 49 ، 50 ، ، من 51 52؛ في الحالات التي يكون فيها هذا النجاح، ستقدم المستخدم مع خريطة كثافة النموذجي والالكترون أولية. وهذا يوفر الأساس للمستخدم لإكمال الصقل والتحقق من صحة النموذج مع أجنحة البرمجيات بلورية الاختيار.

Representative Results

وقد ثبت هذا البروتوكول المتكامل لتكون ناجحة مع أربعة (اثنان هما المنشورة وهياكل) من الكربوهيدرات ستة أهداف البروتين ملزمة من pneumococcus تحليلها حتى الآن32،53. في هذا القسم، نقدم توصيف SP0092 الكيمياء الحيوية والهيكلية كنتيجة ممثل لتوجيه الدراسات الهيكلية سببس بشكل عام. بعد قد أعربت عن SP0092 الاستراتيجية والخطة الاستشرافية وتنقيته كما يعرف سابقا32، وقد تم تحليل البروتين المنقي للاستقرار المخزن المؤقت باستخدام مقايسة تحول حراري: SP0092 المعارض زيادة تيم على درجة الحموضة 6.5 وفي وجود كلوريد الصوديوم في 0-0.2 M نطاق التركيز (الشكل 3A). وفي ضوء هذا، كان يعرف الحل المخزن المؤقت للخطوات التالية: 0.2 M 0.02 م مس pH 6.5، كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 2.5% (v/v)، 0.5 مم تسيب. كتلة المولى المطلقة من دول مختلفة أوليجوميريزيشن SP0092 تم قياسه بواسطة مالس بالإضافة إلى ثانية قياس وزن الجزيئي 187.2 و 140.8 97.0 49.4 كاتشين، المطابق للأنواع تيتراميريك، تريميريك، ديميريك، وموحودي، على التوالي ( الشكل 3). وكشف تحليل للشخصية ثانية في تخفيف البروتينات المختلفة أن أوليجوميريزيشن يتم تشغيلها بواسطة تركيز زيادة البروتين، مما يوحي بأن ليغومرات أكبر أكثر استقرارا في تركيزات أعلى مما يستخدم عادة في تبلور. وفي الواقع، الأنواع oligomeric أكبر المنقي الموجهة إلى بلورة المحاكمات، بلورات البروتين المنتجة بنجاح حين مونومر الأنواع لم. محسن البلورات التي تم الحصول عليها من الأم وسراج الدين-الميثيونين المسمى أشكال SP0092 اتسمت حيود الأشعة السينية. وكشف قياس fluorescence الأشعة السينية من هذه البلورات في كلتا الحالتين قمم الانبعاثات للزنك ملزمة للبروتين، في حين تم الكشف عن سراج الدين فقط لبلورات الميثيونين سراج الدين كما هو متوقع. في وقت لاحق، أجريت فحص امتصاص الأشعة السينية عند حواف سراج الدين والزنك، التي وفرت بيانات تجريبية مباشرة لضبط طول موجه الأشعة السينية الحادث إلى حواف امتصاص الأشعة السينية كل منها الزنك أو سراج الدين الموجودين في البلورات تكبير الإشارات الشاذة يمكن الحصول عليها من البيانات الناتجة عن ذلك (الشكل 4A–ب). وبعد قياس ثلاثة أنماط الحيود في انتقال العدوى منخفض، تم الحصول على مجموعة كاملة من البيانات شاذة استخدام استراتيجية جمع البيانات اقترحها إدنا (الشكل 4). مشغلات الإشارات الشاذة هذا الأنبوب مراحل الآلي في بيمليني لتحديد البنية الفرعية، واستنادا إلى المراحل التجريبية الأولية المشتقة، تنتج الأولى الخرائط والنماذج التي يمكن صقلها والتحقق من صحتها (الرقم 4 ). وباختصار، يتم توسيط المزالق المحتملة لهذه التقنية أساسا على توافر كريستال والجودة. الاستغلال الأمثل للظروف المخزن المؤقت لتحسين الاستقرار البروتين، فضلا عن تحديد الدولة oligomeric أنسب من البروتين لاستخدام، وعندما يتم تحديد أوليجومير واحد أو أكثر في الحل، يمكن أن تقلل من خطر الفشل في بلورة المرحلة. استغلال استخدام أيونات المعادن المرتبطة التي تم تحديدها في مرحلة مبكرة يمكن تسريع بنية الحل وتجنب الإنتاج غير الضروري للمسمى البروتين عندما تفشل أساليب استبدال الجزيئية selenomethionine. رقم 1. رسم تخطيطي لسير العمل لتحديد الخصائص الكيميائية الحيوية والهيكلية من الكربوهيدرات سببس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2. توصيف كريستال في GDA. (أ) لقطة من علامة التبويب التحكم fluorescence الأشعة السينية لبرامج التحكم بيمليني GDA. (ب) لقطة من علامة التبويب التحكم الحافة–تفحص الطاقة الأشعة السينية في GDA. (ج) لقطة من علامة التبويب فرز كريستال جمع البيانات في GDA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3. وصف البيوكيميائية SP009239-491. (أ) 3D-سطح الرسم البياني التآمر درجة حرارة ذوبان SP009239-491 كدالة لدرجة الحموضة وتركيز كلوريد الصوديوم الحل المخزن المؤقت. (ب) ثانية ومالس نتائج SP009239-491. الاستيعاب في 280 nm يظهر باللون الأزرق. الجماهير المولى للدول أوليجوميريزاتيون مختلفة تظهر باللون الأحمر. وقد تم تعديل لوحة (ب) من32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4. وصف الهيكلية SP009239-491. (أ) والطاقة امتصاص الأشعة السينية (ب) مسح على حافة الزنك وسراج الدين لبلورات39-491 SP0092. يبين fluorescence المقاسة من الزنك وسراج الدين الذي يحتوي على بلورات أزرق وسماوي، و المحسوبة ‘و”نثر الشاذة وأجزاء من الأخضر والأحمر، على التوالي. (ج) أمثلة على أنماط حيود الأشعة السينية التي تم جمعها من بلورات39-491 SP0092. (د) كارتون تمثيل هيكل ديمر39-491 SP0092. بروتومير واحد هو اللون الأبيض وغيرها من البنفسجي (بقايا 39-366) والبنفسجي (بقايا 367-491)، وتظهر ذرات نثر الشاذة ككرات زرقاء وسماوي للزنك وسراج الدين، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 0.1 M حمض الستريك pH 4.0 0.1 M حمض الستريك الأس الهيدروجيني 4.5 0.1 M الفوسفات pH 5.0 0.1 M سترات pH 5.5 0.1 M مكررا-تريس pH 6 0.1 م أدا pH 6.5 0.1 M والمماسح الأس الهيدروجيني 7 0.1 M هيبيس درجة الحموضة 7.5 0.1 M ايميدازول pH 8.0 0.1 M تريس pH 8.5 0.1 م أ الأس الهيدروجيني 9 0.1 م أ pH 9.5 كلوريد الصوديوم 0 م 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر كلوريد الصوديوم 0.1 M 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر كلوريد الصوديوم 0.2 M 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر كلوريد الصوديوم 0.5 M 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر 40 ميكروليتر الجدول 1. تكوين المخزن المؤقت للمقايسة التحول الحراري.

Discussion

في هذه الورقة، ونحن تصف والتحقق من صحة بروتوكولا متكاملة لتوصيف البيوكيميائية والهيكلية من الكربوهيدرات سببس مع تركيز بشكل خاص على البروتينات من س. الرئوية. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا كإجراء موحد لتحليل سببس أخرى من الكائنات المختلفة وحتى البروتينات القابلة للذوبان أخرى لا علاقة لها.

الجزء الأول من البروتوكول يركز على توفير المعلومات البيوكيميائية على الاستقرار البروتين وهيكل رباعي، التي يمكن استغلالها في إعداد عينات البروتين لبلورة. في المقطع فحوصات التحول الحراري، يصف لنا فقط على درجة الحموضة وتغيرات تركيز كلوريد الصوديوم للحفاظ على الطابع العام لهذا الإجراء. وعلى الرغم من ذلك، العديد من الشروط الأخرى في المخزن المؤقت يمكن اختبارها بطريقة مشابهة، على سبيل المثال، بما في ذلك أي مجمع الكيميائية المستخدمة كمادة مضافة استقرار: خاصة ligand(s) الفعلية التي تربط الاستراتيجية والخطة الاستشرافية محددة فعالة بشكل ملحوظ في زيادة تم ببضع درجات مئوية31. وفي بعض الحالات، يمكن تعريف منحنيات يشوه سيئة بسبب إشارة منخفضة أو خلفية فلورية عالية، الذي يحدث بسبب تراكم البروتين أو تتكشف جزئيا. لتجنب هذا الأمر، يمكن أن يؤديها معايرة بروتين: صبغ لتحسين المنحنيات يشوه غير واضحة. إذا تم الحصول على أي تحسن، ينصح بفحص المضافات المختلفة التي يمكن تحسين استقرار البروتين، وشاشات مناسبة تم وصفه سابقا54.

بشكل عام، سببس معظم أحادي في بيئتهم الطبيعية، ولكن كما هو موضح هنا مولتيميريزيشن يمكن أن تحدث في تركيزات أعلى تستخدم في تجارب التبلور، وبالتالي توصيف السلوك أوليجوميريزاتيون التي تقدمها مالس وثانية أساسية لتقييم حالة أوليجوميريزيشن مونوديسبيرسي مستقرة مواتية أكثر لبلورة. ومع ذلك، من الصعب التنبؤ بتأثير مختلف المواد الكيميائية المدرجة في حالة تبلور على السلوك أوليجوميريزيشن من البروتينات. إذا تبين دراسة ثانية ومالس تجميع واسعة من العينة البروتين، سوف ننصح التالية للحد من احتمال حدوث هذا الأمر: استخدام عينة جديدة من البروتين (عدم تجميد مذاب) وتوسيع نطاق التحليل استقرار أداء مع الحرارية تحول فحوصات، اختبار المواد المضافة المحتملة والمنظفات معتدل كمورد آخر، للحد من التراكم. في هذه الورقة، نقدم المبادئ التوجيهية الأساسية لبلورة استخدام مصفوفة متناثر الفائق التجاري تبلور الفرز للحفاظ على الطابع العام لهذا البروتوكول. ومع ذلك، الحصول على بلورات البروتين حيود الأشعة السينية ذات الدقة العالية قد تحتاج إلى ضبط تكراري لتحسين ظروف التبلور فيما يتعلق بتركيز مرسب، الرقم الهيدروجيني، وإضافة المواد الكيميائية المضافة، درجات حرارة مختلفة، و عوامل أخرى تغير ديناميات توازن بين كريستال الخزان وإسقاط16،17.

ويصف الجزء الثاني من البروتوكول توصيف بلورات البروتين بغية تحديد الاستراتيجية المثلى لجمع البيانات حيود الأشعة السينية مع تركيز بشكل خاص على الحصول على البيانات الشاذة لمراحل الحزن. حتى لو سببس الحفاظ على بنية عامة مماثلة (وهناك العديد من الهياكل 3D المودعة يحتمل أن تكون صالحة للاستعمال كبداية النماذج)، التخلص التدريجي من هذه البروتينات بطريقة الاستبدال الجزيئي ليست دائماً واضحة بسبب التباين عناصر البنية الثانوية والمرونة المتأصلة في هذه البروتينات. ومن ثم اقتراح أسلوب حزين، وتسليط الضوء على أن هذه البروتينات قد يكون جوهريا منضم بالفعل المعادن أو ملزمة في الواقع غير محددة من المعادن من ظروف التبلور المخزن المؤقت، التي يمكن أن توفر مجموعة من العناصر ديفراكتينج الشاذة الخطوة القياسية في البروتوكول العام أعمالنا.

وفي الختام، يعرف هذا البروتوكول سير عمل إرشادية قياسية للإجراءات التي تتيح لوصف مفصل لميزات سببس التي يمكن استغلالها لزيادة معدل نجاح تصميم الهيكل، فضلا عن الإسراع في الكيمياء الحيوية والهيكلية وصف سببس الهيكلية بصورة عامة.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونعترف أوبف-المملكة المتحدة لتقديم المساعدة في مجال الاستنساخ، “هاريس جيما” مولات ثانية والعلماء من بيملينيس I03 و I04 في “الماس مصدر الضوء”.

Materials

SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide – includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop – 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway?. Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Bergfors, T. . Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. , (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The “Venus’s-flytrap” model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD?. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection – current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Tags

Carbohydrate TransportSubstrate-binding ProteinStreptococcus PneumoniaeBiochemical CharacterizationStructural CharacterizationBuffer StabilityOligomerizationCrystallizationSize-exclusion ChromatographyMulti-angle Light ScatteringPre-crystallization TestingProtein ConcentrationCrystallization Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image